非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选。结果获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G10-2和6D2-1。抗体效价分别为1∶12800和1∶3200。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,2株单克隆抗体与p30蛋白均具有良好的结合活性。通过Western blot检测,2株单克隆抗体能有效结合截短重组p30蛋白的170~194位氨基酸,证明其抗原识别区域为第170~194位氨基酸。本研究制备了p30蛋白的2株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为ASFV p30蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。

弓形虫表面抗原P30基因分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因的分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达重组质粒并进行其序列测定。方法 弓形虫RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,酚 /氯仿法抽提基因组DNA ;根据基因库P30基因序列设计合成一对引物 ,采用PCR法扩增编码P30的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将P30基因定向克隆到分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5dα,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR鉴定 ;最后对重组子进行序列测定。结果 PCR所扩增的P30基因片段为 10 37bp ,阳性重组质粒pBCG -P30经XbaI+KpnI双酶切 ,获得包含P30和热休克蛋白 (hsp70 )启动子的复合基因片段 ,此片段的大小为 1170bp ,与预期的理论值相符合。序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P30抗原的基因片段。结论 成功构建编码弓形虫表面抗原P30基因大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒pBCG -P30。

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。

弓形虫主要表膜P30抗原的免疫保护作用研究

目的 研究弓形虫主要表膜P30抗原免疫小鼠所诱导的免疫性保护作用及免疫保护机制。方法 将单克隆抗体免疫亲和层析分离纯化的P30抗原免疫C57BL/ 6纯系小鼠 ,然后用弓形虫RH株速殖子和Fukaya株包囊攻击感染 ,观察P30抗原免疫对急性弓形虫感染鼠死亡时间及慢性感染鼠脑内包囊形成的影响 ,同时对感染后不同时间鼠血清特异性抗体水平、IL 2及IFN r细胞因子水平和脾T淋巴细胞亚群的动态变化进行了测试分析。结果 显示P30抗原免疫可在一定程度上延长感染小鼠的存活时间 ,减少脑内包囊的形成数量 ,增强小鼠抵抗急慢性弓形虫感染的能力。在感染后不同时期免疫鼠血清中特异性抗体水平及IFN r、IL 2水平均高于同期对照鼠 ,而且免疫鼠脾CD4 + 和CD8+ T淋巴细胞尤其是CD8+ 细胞的数量在感染早期升高较快 ,至感染后第 4周达高峰 ,两者的比值随感染时间的延长而逐渐下降。结论 P30抗原免疫对感染小鼠具有明显的保护作用 ,是细胞免疫和体液免疫共同作用的结果 。

弓形虫P30蛋白抗原表位的克隆表达及纯化鉴定

目的构建表达P30蛋白抗原表位的重组质粒及工程菌,获得纯化的P30蛋白抗原表位,用于检测弓形虫特异性抗体。方法采用PCR技术,设计一对引物(P30P3、P30P4),从弓形虫基因组DNA中扩增出编码P30蛋白抗原表位的基因片段,与载体pET28a(+)连接,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析。用离子交换纯化表达的P30抗原表位,用ELISA鉴定其抗原性。结果表达的P30蛋白抗原表位以包涵体形式存在,纯化的P30蛋白抗原表位片段有较好的抗原性,可用于检测弓形虫抗体。结论已成功构建了高表达P30蛋白的工程菌,为研制弓形虫抗体检测试剂或疫苗奠定了基础。

弓形虫P30抗原基因的体外扩增、克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应，从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养基初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法 将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论 成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 。

禽网状内皮组织增殖病病毒PCR及RT-PCR检测方法的研究和p30主要抗原域的原核表达

根据MONAM.ALY发表的一对引物,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAAGGGCAGA-3'(上游引物),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(下游引物),上游引物位于REV-SNV毒株LTR序列上游237bp到267bp,下游引物在499bp到517bp之间,扩增产物总长为281bp。以REV-T株感染的鸡胚成纤维细胞DNA作为PCR扩增模板,进行PCR扩增,提取病毒RNA进行RT-PCR,这两种方法均获得了禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,将其克隆入pGEM-TEasy克隆载体中,经测序,证实为禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,初步建立了REV的PCR和RT-PCR检测方法。人工合成了REVp30的主要抗原域,用构建成功的表达禽网状内皮增生症p30主要抗原域的原核表达载体pET-p30,转化大肠杆菌BL21,挑取阳性克隆培养,IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE分析,出现大小约25Ku的表达产物即融合蛋白TrxA-p30主要抗原域,经Westernblot验证融合蛋白具有REV特异的反应原性。采用常规表达条件:LB培养基,37℃培养,待菌生长至OD600为0.4h～0.6h,用终浓度为0.2mmol/L～0.8mmol/L的IPTG进行诱导,于37℃振荡培养4h～5h,均能高效表达。本研究为建立REV抗体的ELISA检测方法打下基础。

抗-p30单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

作者用纯化的p30抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合率为93.95％,抗体阳性率为21.01％。经克隆化,获得两株分泌抗-p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株E_8与G_1。染色体计数:E_8为98.7±6.54;G_1为97.7±7.77。PAGE于γ区出现浓染的蛋白带。免疫组织化学染色和ELISA抑制试验证实该两株细胞分泌的抗体具有较好的种属特异性和器官特异性。均属IgG_2。都不能使人精子凝集和制动。

抗弓形虫表膜抗原 P30单克隆抗体的制备与鉴定(英文)

为制备抗弓形虫主要表膜抗原 P30单克隆抗体并进行鉴定 ,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫 BAL B/ c小鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2 / 0融合 ,筛选出能够稳定分泌高滴度抗 P30单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价 ,用 IFAT进行单抗识别的抗原定位 ,并通过 SDS- PAGE和 Western- Blot分析鉴定。结果获得了两株抗 P30抗原的杂交瘤细胞株 E3和 G2 ,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。 2株单抗均属 Ig G1亚类 ,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明 ,制备的抗 P30抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。

弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定

目的 应用单克隆抗体免疫亲和层析技术提纯弓形虫主要表膜P30抗原并进行鉴定。方法 将我们已建立的分泌抗表膜P30抗原单克隆抗体的E3杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔 ,收集腹水 ,用饱和硫酸胺沉淀和DEAE—纤维柱层析法提纯单克隆抗体 ,将其偶联至溴化氢活化的琼脂糖 4B上装柱 ,经免疫亲和层析技术 ,从大量的低功率超声粉碎速殖子抗原中分离纯化P30蛋白质 ,并用SDS—PAGE进行鉴定。结果 本次实验约获得了 8 1mg的P30蛋白质 ,且纯度较高。结论 单克隆抗体免疫亲和层析技术可获得一定量的P30抗原。

抗弓形虫主要表膜P30抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗弓形虫主要表膜P30抗原单克隆抗体 (McAb)并进行鉴定 ,为弓形虫病的诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的研制等提供可靠依据。方法 用RH株弓形虫速殖子膜抗原为免疫原免疫BALB/C小鼠 ,取其脾细胞与小鼠SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,筛选出能够稳定分泌高滴度抗P30抗原McAb杂交瘤细胞株 ,并测定McAb免疫球蛋白亚类和单抗效价 ,用IFAT进行单抗识别的抗原定位 ,并通过SDS PAGE和Western blot分析鉴定。结果 本实验获得了 2株抗P30抗原的杂交瘤细胞株E3 和G2 ,分泌的抗体滴度分别为 1∶2 5 880和 1∶10 2 6 0 ,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应 ,2株单抗均属IgG1亚类 ,且识别的抗原定位于速殖子表膜。

用双抗夹心间接ELISA方法检测p30确证人类精斑

检测p30确证精斑有下列几种方法：免疫扩散，免疫电泳，交叉免疫电泳，胶乳凝集抑制试验，薄层免疫分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)。这些方法各有优缺点，就灵敏度而论，则以酶联免疫吸附试验为高。最近，我们在国家自然科学基金会的资助下，建立了双抗夹心间接ELISA法来确证人类的精斑，获得了满意的结果，现报导如下：

弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的 构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒,为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法 自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子,用酚/氯仿法提取基因组DNA,用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化),定向插入到PQE-30表达质粒中,转化入TG1宿主菌,在含有青霉索的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果 阳性重组质粒PQE30-P30经Sal+HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp,通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论 成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。

抗P30胶体金免疫试纸条灵敏度和特异性探讨

目的探讨抗P30胶体金免疫试纸条的灵敏度和特异性以及假阳性问题。方法按试纸条说明书的方法,对14份阴道分泌液、9份尿液、5份唾液、5份汗液、5份未经治疗的多囊卵巢综合征阴道分泌液,人、鸡和猪精液进行检测。结果5分钟时观察除人精液外,其余收集样品均为阴性,10分钟时观察除4份阴道分泌液、1份多囊卵巢综合征阴道分泌液呈阳性外,其余样本结果仍为阴性。试纸条的灵敏度达到10000-100000倍。结论试纸条的灵敏度、特异性较高,具有一定的种属特异性。但为了避免假阳性的出现,建议将样品稀释10倍,5分钟之内观察结果。

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

人类精浆特异性抗原p30理化性质的初步研究

作者在分离纯化人类精浆特异性抗原p30的基础上,用不同凝胶浓度的SDS-PAGE检测该纯化p30的分子量,用等电聚焦检测其等电点,并分析其氨基酸组成。结果证明p30与前列腺特异性抗原属同一种糖蛋白。本文还探讨了不同作者所测p30理化参数不一致的原因。

弓形虫ZS2株抗原基因的扩增及克隆

扩增弓形虫ZS2株P30抗原基因，构建PcDNA3—P30真核表达重组质粒。方法本文采用PCR技术，自行设计一对寡核苷酸引物（P1，P2），从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRI和Hind双酶切后，克隆到真核表达质粒pcDNA3中，转化入大肠杆菌TG1，用氨共青霉素和PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EcoRI和Kind双酶切鉴定。结果从弓形虫ZS2株DNA中扩增出1025bP的P30基因，构建重组质粒PcDNA3—P30，酶切产物的大小分别与预期相符。结论成功地对弓形虫ZS2株P30基因进行体外扩增及构建真核表达重组质粒PcDNA3—P30，为重组P30抗原及核酸疫苗研究做好准备。

重组抗原金标免疫渗滤法检测弓形虫感染的研究

目的:建立一种快速、简便的弓形虫病诊断方法。方法:将弓形虫P30重组抗原包被于硝酸纤维膜上,以金标免疫渗滤法(DIGFA)检测兔血清中相应抗体,呈现红色斑点者为阳性。结果:检测弓形虫感染兔血清41份,阳性率为97.56%(40/41),检测正常兔血清20份,感染囊虫兔血清26份,感染血吸虫兔血清40份,感染丝虫兔血清21份,感染肺吸虫兔血清33份,仅2份血吸虫感染兔血清出现交叉反应。结论:弓形虫P30重组抗原金标免疫渗滤法检测弓形虫感染兔有较高的敏感性和特异性。

抗弓形虫单克隆抗体的制备鉴定及应用

目的制备抗弓形虫全抗原、天然P30、重组P30的单克隆抗体(McAb),为抗原提纯、弓形虫病诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。方法用弓形虫全抗原、天然P30、重组P30分别免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选稳定分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定McAb亚类和效价;通过SDS-PAGE和Westernblot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目;利用电镜及IFAT观察McAb对弓形虫的杀伤作用及其作用位点。结果筛选出3株(4B10、2B3、1H6)特异性较好的杂交瘤细胞株。Westernblot结果显示,2B3、1H6产生的McAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30kDa处,4B10反应带主要在22kDa处;2B3,1H6,4B10McAb的效价(ELISA)分别为:1∶102400、1∶51200、1∶12800;2B3、1H6为IgM,4B10为IgG2b;3株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察到McAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀,表面出现缺口和空洞,虫体变形破碎、膜变厚。抗弓形虫全抗原及天然P30的McAb能准确识别重组体pET-30a-ROP2、pET-30a-P30的表达蛋白。结论抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用,能准确识别P30抗原,可应用于弓形虫病诊断、抗原鉴定及亚单位疫苗的研制。