BUB1、DPPA2、P311在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性研究

胃癌在消化系统中发病率较高,是恶性肿瘤死亡原因之一[1]。胃癌细胞多种分子的表达异常在治疗及诊断中有重要意义[2,3]。BUB1是纺锤体检测点的蛋白,在胃癌中染色体的不稳定是由BUB1表达异常出现细胞恶性情况引起的[4]。多能发育相关基因2(developmental pluripotency associated gene 2,DPPA2)在多能性细胞中发现,在机体发育过程中DPPA2与细胞的多能性有密切关系[5]。胃癌组织中增生性瘢痕相关蛋白(抗原)(P311 protein,P311)蛋白表达量异常增高,且其具体表达量与肿瘤细胞增殖、侵袭、自噬等恶性生物学行为直接相关[6]。本次研究旨在研究BUB1、DPPA2、P311在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性,为临床提供数据参考。

以酵母双杂交系统从成人肝cDNA文库中筛选与研究P311相互作用蛋白的基因序列

目的应用酵母双杂交技术研究与增生性瘢痕相关新候选蛋白P311发生相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交系统,以人P311为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的阳性克隆。以回复性杂交试验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果经过酵母双杂交共获得355个克隆,经过测序和验证,最终确认8个克隆基因。结论获得的8个基因编码的蛋白可能与P311的作用过程有关。

地塞米松对兔胆道成纤维细胞P311/TGF-β1/α-SMA通路表达的影响

目的:研究地塞米松(dexamethasone,DEX)对兔良性胆道狭窄(benign biliary stricture,BBS)模型胆管成纤维细胞(model fibroblast,MF)中P311/转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)通路表达的影响。方法:取2只家兔正常胆管培养正常胆管成纤维细胞(normal bile duct fibroblasts,NF),对2只家兔采用切开再吻合方法建立BBS模型并获取MF,进行细胞鉴定后分组为:NF、MF、MF+不同浓度的DEX(0.02,0.1及0.5 mg/m L)组,各组给予对应浓度的DEX干预48 h,CCK-8细胞计数法测定各组细胞增殖水平;q RT-PCR检测各组细胞P311、TGF-β1及α-SMA基因m RNA表达水平;Western blot检测各组细胞TGF-β1及α-SMA蛋白表达水平。结果:(1)各组细胞A值:NF为0.331±0.002,MF组为0.533±0.005,MF+DEX 0.02组为0.487±0.003,MF+DEX 0.1组为0.434±0.004,MF+DEX 0.5组为0.381±0.004。(2)各组细胞P311 m RNA值:NF组为1.000 0±0.024 8,MF组为4.146 3±0.037 1,MF+DEX 0.02组为3.789 9±0.056 8,MF+DEX 0.1组为3.566 1±0.148 1,MF+DEX 0.5组为2.945 8±0.165 4。(3)各组细胞TGF-β1 m RNA值NF组为1.000 0±0.034 6,MF组为2.647 9±0.048 5,MF+DEX 0.02组为1.929 7±0.054 8,MF+DEX 0.1组为1.678 2±0.080 2,MF+DEX 0.5组为1.676 2±0.036 9。(4)各组细胞α-SMA m RNA值:NF组为1.000 0±0.056 0,MF组为4.025 7±0.065 9,MF+DEX0.02组为3.644 9±0.196 4,MF+DEX 0.1组为2.712 9±0.102 4,MF+DEX 0.5组为2.320 7±0.031 2。(5)各组细胞TGF-β1蛋白值:NF组为0.999 6±0.046 3,MF组为2.096 3±0.029 3,MF+DEX 0.02组为1.781 8±0.040 4,MF+DEX 0.1组为1.531 4±0.032 5,MF+DEX 0.5组为1.384 0±0.035 7。(6)各组细胞α-SMA蛋白值:NF组为1.000 8±0.051 4,MF组为3.231 4±0.116 0,MF+DEX 0.02组为2.875 3±0.078 0,MF+DEX 0.1组为2.262 8±0.059 8,MF+DEX 0.5组为1.940 8±0.093 7。在DEX干预48 h后,MF增殖明显受到抑制,细胞P311、TGF-β1及α-SMA基因m RNA及蛋白表达明显下调(均P<0.05,0.1~0.5 mg/m L),呈现浓度依耐性。结论:DEX抑制BBS形成的作用机制之一可能与它对MF中P311/TGF-β1/α-SMA通路的调控有关。

利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用

目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypotheticalprotein,HT036)和P311间的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用。结果构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Westernblot检测,可以检测到HA-HT036的表达。结论成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用。

荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用

目的利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用。方法分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R)。结果重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3nm。结论成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用。

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定。方法通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白。结果重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符。该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白。结论构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础。

P311蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义研究

目的探讨P311蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法 2016年7月-2019年3月间在廉江市人民医院接受手术治疗的胃癌患者110例,根据病理分期分为早中期胃癌组61例、晚期胃癌组49例,另取同期在本院进行胃镜检查的浅表性胃炎患者50例作为胃炎组。取三组研究对象的病灶组织,采用western-blot法测定其中P311蛋白表达量,采用荧光定量PCR法测定其中增殖、侵袭、自噬基因的mRNA表达量。采用Pearson法评估胃癌组织中P311蛋白表达量与肿瘤恶性分子mRNA表达量的相关关系。结果早中期胃癌组、晚期胃癌组的P311蛋白表达量显著高于胃炎组,且晚期胃癌组的P311蛋白表达量高于早中期胃癌组(P<0.05)。早中期胃癌组、晚期胃癌组的增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1的mRNA表达量高于胃炎组,p16的mRNA表达量低于胃炎组;侵袭基因ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9的mRNA表达量高于胃炎组,Sema3A的mRNA表达量低于胃炎组;自噬基因Beclin1、MAPLC3 mRNA表达量低于胃炎组,LC3mRNA表达量高于胃炎组;晚期胃癌组上述基因mRNA改变程度高于早中期胃癌组(P<0.05)。胃癌组织中P311蛋白表达量与增殖、侵袭、自噬基因mRNA表达量呈正相关(P<0.05)。结论 P311蛋白在胃癌组织中呈异常高表达,且具体表达量与肿瘤细胞增殖、侵袭、自噬活性均直接相关,是胃癌发生发展的重要因子。

P311和TGF-β1在IgA肾病肾组织中的表达及意义

目的探讨P311和转化生长因子β1(TGF-β1)在Ig A肾病(Ig AN)肾组织中的表达及意义。方法应用免疫组织化学方法检测57例Ig AN肾组织(Ig AN组)和5例正常肾组织(对照组)中P311和TGF-β1的表达情况,同时测定Ig AN患者24 h尿蛋白定量、血压、血清肌酐(SCr)、肌酐清除率等,分析P311、TGF-β1表达与不同临床分组、病理分级、有无高血压、蛋白尿程度、SCr水平的关系。结果 Ig AN组患者肾组织中P311表达明显高于对照组,且与病理分级呈正相关;小管间质中P311表达与TGF-β1表达、24 h尿蛋白定量等明显相关;SCr>133μumol/L组患者肾组织中P311表达高于SCr<133μmol/L组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在Ig AN肾组织中P311表达与TGF-β1表达、蛋白尿、肾脏病理分级相关。P311是肾组织纤维化过程中的关键因子,且参与了Ig AN疾病进展。

整合素β4结合蛋白与P311在人胚肾293细胞中的表达及共定位

目的:利用激光共聚焦显微镜共定位检测整合素β4结合蛋白与P311蛋白在细胞内的分布,进一步证实它们在细胞内产生相互作用的可能性。方法:实验于2006-03/12在解放军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。先分别构建能在哺乳动物细胞中表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体,经酶切鉴定正确后,利用脂质体介导法共转染人胚肾293细胞后,激光共聚焦显微镜进行共定位观察。结果:表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体经双酶切鉴定正确,转染293细胞后,荧光显微镜下能观察到绿色和红色荧光。激光共聚焦显微镜下观察两者主要分布在293细胞的胞浆和胞核中,并且存在着共定位现象。结论:表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体在空间分布上两者存在相互作用的物质基础。

p311在肺发育及损伤修复中的研究进展

呼吸窘迫综合征是临床危重新生儿尤其是早产儿常见的临床综合征,患儿由于肺泡表面活性物质缺乏而导致肺泡发育障碍,严重时可危及患儿生命。氧疗和辅助通气是改善患儿缺氧状态的重要治疗方法,长时间高氧暴露使未成熟肺的肺泡上皮细胞损伤、坏死,从而导致急性肺损伤,最终由于呼吸功能衰竭引起支气管肺发育不良。近年来,支气管肺发育不良在全球发病率逐年递增,存活者常伴有明显的肺功能低下和肺发育不良,目前尚无确定有效的治疗方法。p311基因是一种新发现的功能基因,在人体各器官广泛分布,物种间高度保守,其参与神经、肺及损伤上皮细胞的再生,维持血压平衡,促进肾纤维化及胶质瘤的侵袭等。

P311在肺泡发生中的作用初探(英文)

P311是一个由肺泡形成相关阶段相对于肺泡成熟期差减杂交文库中获得的上游调节基因,为探讨其在肺泡发生过程中的可能作用,本文以真实时间PCR(real time PCR)和免疫组织化学方法确定了P311在肺器官发育过程中的表达特点,结果显示P311的表达无论在时间上还是在组织细胞分布上都与肺泡的发生密切相关.同时胎肺细胞植模型中,反义寡核苷酸阻断P311表达的研究亦显示P311在肺泡分隔膜形成过程中的重要性.

参芪解毒汤联合P311在肾间质纤维化过程中对α-SMA及α-SMA2mRNA表达的影响

目的观察参芪解毒汤联合P311在慢肾衰大鼠肾间质纤维化过程中对α-SMA蛋白表达及α-SMAmRNA的影响,从而明确参芪解毒汤联合P311在慢肾衰肾间质纤维化的过程中的作用,为指导临床提供依据。方法健康雄性SD大鼠60只,除正常对照组外,其余均用UU法制备慢肾衰的动物模型。将大鼠随机分为正常对照组、模型组、模型+中药组、模型+P311转染组、模型+P311转染+中药组、模型+P311转染+科素亚组。利用western blot方法检测各组中α-SMA蛋白的变化;采用实时荧光定量PCR法检测α-SMAmRNA的表达。结果与正常对照组比较,α-SMA各组表达均高于正常对照组且差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,用药各组差异均有统计学意义(P<0.01);与模型+P311+中药组比较,模型+P311+科素亚组与其差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组及其他各组α-SMAmRNA差异均有统计学意义(P<0.01);与模型+中药+P311组比较,模型+中药组、模型+P311组差异均有统计学意义(P<0.01),模型+科素亚+P311组与其差异无统计学意义(P>0.05)。结论参芪解毒汤联合P311可减轻肾脏纤维化的程度,延缓慢肾衰大鼠模型肾间质纤维化的过程,这可能与降低α-SMA的蛋白以及α-SMAmRNA的表达有关。

P311蛋白与金属硫蛋白ⅡA相互作用位点的计算机预测

P311蛋白广泛表达于多种组织,并参与体内细胞分化、调节其他蛋白/基因转录、创伤修复、肿瘤发生等多种正常或异常的生物学活动.研究发现,金属硫蛋白ⅡA(metallothionein ⅡA,MT2A)参与P311基因的表达,并起着关键性的调节作用,这说明二者存在着相互作用的关系.采用同源建模的方法构建P311蛋白的3D结构,使用Autodock 4.0软件将结构模型与MT2A进行分子对接,模拟蛋白质间的相互作用,预测二者的作用区域,找出可能的关键残基GLU14,SER48以及GLU56,为进一步的实验研究奠定基础.

小鼠P311蛋白与类赖氨酰氧化酶-1相互作用的鉴定

P311是利用抑制差减杂交技术从小鼠肺组织中筛选到的一个肺泡发育上游调节基因.它高水平表达于肺泡发育的相关阶段,而在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者肺组织中表达水平大大下降.为深入探讨P311蛋白的作用机制,构建pGBKT7-P311诱饵表达载体,利用酵母双杂交技术,从小鼠肺组织cDNA文库中筛选出P311相互作用蛋白类赖氨酰氧化酶-1(lysyl oxidase-like 1,Loxl-1).并通过体内外免疫共沉淀及双分子荧光互补实验进行验证.为进一步研究P311蛋白的生物学功能提供新的思路。

P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

目的观察P311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照，同法取止常皮肤标本。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶（SP）染色法观察P311在上述皮肤组织中的表达。（2）取6只新生的C57BL／6小鼠，连续3d腹腔注射50μg／g溴脱氧尿苷（BrdU，2次／（1）建立ESC示踪模型。7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面。伤后72h取创面皮肤组织制作连续切片，SP法免疫组织化学染色，观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况。（3）构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋h（EGFP）及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311，并进行包装。应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为P311高表达组和EGFP对照组，每组3孔，分别以pAdEasy-EGFP-P311及pAdEasy-EGFP腺病毒感染ESC。2组ESC经丝裂毒素C处理2h后行划痕实验。划痕后0（即刻）、24、48、72h测量地固定范围内划痕剩余面积，计算划痕愈合面积百分比。对数据进行独立样本t检验。结果（1）浅Ⅱ度烧伤后不同时相点，P311在创面不同部位的表达量各不相同。伤后创面毛囊、新生表皮巾P311表达量随时间延长逐渐上升；创用表皮及毛囊的P311表达量于伤后12h达高峰，72h回落至正常。（2）应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创Ⅲ新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位。（3）划痕后48、72h，P311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为（69±31）％、（89±26）％，明显高于EGFP刘照组[（35±12）％、（46±31）％，t值分别为-2．336、-2，611，P值均小于0．05]。结论P311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移，可能在创面修复中起重要作用。

P311和整合素β4结合蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的 探讨P311和整合素β4结合蛋白（ITGB4BP）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义.方法 80例NSCLC石蜡标本制成组织芯片,采用链菌素亲生物素-过氧化物酶法（SP）检测F311和ITGB4BP的表达情况,应用SPSS 13.0软件进行统计分析.结果 P311和ITGB4BP在NSCLC中的阳性表达率分别为77.5%（62/80）和82.5%（66/80）,P311和ITGIMBP表达均阳性者占73.8%（59/80）,一致率为87.5%,具有显著一致性（Kappa=0.611,P〈0.001）.结论 NSCLC中可能存在一条新信号途径P311-ITGB4BP,且可能具有调节肺癌细胞迁移的作用.

缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响

目的体外条件下模拟缺氧环境，探讨P311和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）相互作用及对小鼠表皮干细胞（ESC）迁移影响。方法取15只C57BL/6J野生型新生小鼠，5只同属来源P311基因敲除新生小鼠，分离培养2种小鼠ESC，取第1代细胞行形态学观察，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验。（1）取2种小鼠ESC划痕处理后，立即按随机数字表法（下同）将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组（将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养，常氧处理下同）和缺氧组（将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养，缺氧处理下同），每组12个插件；将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜（DMSO）对照组（用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养）、HIF-1α抑制剂组（加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养）、HIF-1α稳定剂组（加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养），每组12个插件。每组各时相点取3个插件分别于划痕后0（即刻）、12 、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度。（2）取野生型小鼠ESC行缺氧培养，蛋白质印迹法检测缺氧0（即刻）、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达。（3）取野生型小鼠ESC同实验（1）分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理，分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达，免疫细胞化学染色法观测P311表达（样本数均为12）。（4）取第2代人胚胎肾293（HEK-293）细胞分为空载缺氧组（转染空载质粒后进行缺氧培养）、P311常氧组（转染P311报告基因质粒后进行常氧培养）、P311缺氧组（转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养）、P311缺氧＋HIF-1α抑制剂组（HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养），分别于培养0、12 h检测荧光素酶活性，采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bonferroni校正。结果（1）ESC结果。细胞呈现铺路石样改变，细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态。CD71－CD49f＋细胞占85%左右，说明ESC的干性较强、纯度较高。与P311基因敲除小鼠常氧组比较，单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05），缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05）。与野生型小鼠常氧组比较，缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（P〈0.05）。与单纯缺氧组比较，缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大（P值均小于0.05），HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大（P〈0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05）。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显（F＝19.02，P〉0.05）。野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03。与缺氧0 h比较，HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加（P〈0.01），缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h（P〈0.05），缺氧48 h后降至常氧水平（P〉0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降（P值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311 mRNA表达量均明显升高（P值均小于0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降（P值均小于0.05），而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。（2）HEK-293细胞结果。培养0 h，空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧＋HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（F＝13.33，P〉0.05）。培养12 h，P311缺氧组细胞荧光素酶活性较空载缺氧组高（P〈0.01）；P311缺氧组细胞荧光素酶活性较P311常氧组高（P〈0.05）；P311缺氧＋HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性较P311缺氧组低（P〈0.01）。结论缺氧早期，HIF-1α可能通过诱导P311表达促进小鼠ESC迁移。

P311和转化生长因子β1相互作用及其对小鼠成纤维细胞功能的影响

目的 探讨P311和TGF—β1在小鼠皮肤Fb中的相互作用及其对Fb功能的影响。方法取P311野生型和P311基因敲除型C57BL／6新生小鼠各5只，分离培养2种小鼠皮肤Fh。采用第2代Fb完成以下实验，每个实验重复3次。（1）取P311野生型小鼠Fb，按随机数字表法（分组方法下同）分为空白对照组和P311过表达组，每组36孔。空白对照组每孔加入10μL空载体腺病毒，P311过表达组每孔加入等效价P311腺病毒表达载体。培养48h后，采用实时荧光定量RT—PCR法和蛋白质印迹法分别检测2组Fb的P311mRNA及TGF—β1、α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、I型胶原的mRNA和蛋白表达量（检测方法下同）。（2）取P311野生型和P311基因敲除型小鼠Fb各4瓶，待细胞生长至80％～90％融合时，检测2种Fh的TGF—β1、a-SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量。（3）取P311野生型小鼠Fb用体积分数为1％FBS的DMEM培养液饥饿处理3h后，分为空白对照组及5、10、15、20、25ng／mLTGF—β1组，每组2瓶。空白对照组常规培养，后5组F11分别加入5、10、15、20、25ng／mLTGF—β1溶液，培养48h后检测6组F11的P311mRNA表达量。另取P311野生型小鼠Fh，分为空白对照组和10ng／mLTGF—β1组，每组6孔，免疫荧光法检测2组Fb的P311蛋白表达情况。（4）将P311野生型小鼠F11同前饥饿处理后，分为空白对照组和10ng／mLTGF—β1组，每组2瓶，空白对照组常规培养，后组加入10ng／mL的TGF-β溶液，培养48h后，检测2组Fh的d—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量。取P311基因敲除型小鼠Fb，同前分组及处理后，检测2组Fh的d—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量。对数据行单因素方差分析、t检验。结果（1）P311过表达组Fh的P311mRNA表达水平较空白对照组增高近30万倍（t=9．942，P〈0．001）。P311过表达组Fh的TGF—β1、d—SMA、I型胶原的mRNA，以及TGF-β1前体、TGF—β1活化态、a-SMA、I型胶原的蛋白表达量均较空白对照组明显升高（t值为8．192～49．090，P值均小于0．01）。（2）P311基因敲除型小鼠F1]的TGF—p．、d—SMA、I型胶原的mRNA表达量较P311野生型小鼠Fb明显降低（t值为8．157～22．270，P值均小于0．01）。P311基因敲除型小鼠Fb的TGF-β1前体、a-SMA、I型胶原的蛋白表达量较P311野生型小鼠Fb明显降低（t值为2．995～12．600，P〈0．05或P〈0．01），2种Fb的TGF—β1活化态蛋白表达量相近（t=1．070，P〉0．05）。（3）空白对照组及5、10、15、20、25ng／mLTGF—β1组Fb的P311mRNA表达量分别为1．28±0．44、3．61±0．91、6．64±0．92、6．58±1．04、1．79±0．31、0．16±0．06。与空白对照组Fh的P311mRNA表达量比较，5、20ng／mLTGF-β1组无明显变化（t值分别为2．302、0．955，P值均大于0．05），10、15ng／mLTGF—β1组明显增高（t值分别为5．630、4．710，P值均小于0．001），25ng／mLTGF-β1组明显降低（t=2．509，P〈0．01）。10ng／mLTGF—β1组Fh的P311蛋白表达明显强于空白对照组。（4）P311野生型小鼠10ng／mLTGF—p，组Fh的d—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高（t值为3．523～14．290，P〈0．05或P〈0．01）。P311基因敲除型小鼠10ng／mLTGF—β1组Fb的a—SMA、I型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高（t值为4．895～14．870，P〈0．05或P〈0．01）。结论P311和TGF—β1在小鼠皮肤Fb中存在相互作用，可共同促进Fb的分化。

载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

目的探讨载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。通过油包水乳化法制备聚乙烯醇/海藻酸钠微球(单纯微球)、P311微球及异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)微球,于光学显微镜/倒置荧光显微镜下观察形貌。制备壳聚糖溶液,将壳聚糖溶液和β-磷酸甘油二钠水合物混合制备单纯温敏水凝胶,在单纯温敏水凝胶中加入相应物质制备载单纯微球和载P311微球的温敏水凝胶,观察4种液体在37℃时倾斜状态下的形态变化,冷冻干燥后于扫描电子显微镜下观察微观形貌。取18只3~4周龄雄性SD大鼠,分为不进行任何处理的正常组及于背部脊柱两侧分别制作1个全层皮肤缺损创面并进行相应处理的敷贴组、壳聚糖组、单纯水凝胶组、载单纯微球水凝胶组、载P311微球水凝胶组,每组3只。取5组全层皮肤缺损大鼠,于伤后0(即刻)、5、10、15 d观察创面愈合情况,计算伤后5、10、15 d创面愈合率;取5组全层皮肤缺损大鼠伤后15 d创面和创缘组织及正常组大鼠相同部位正常皮肤组织,行苏木精-伊红染色观察组织学变化,行免疫组织化学染色观测CD31及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,采用蛋白质印迹法检测CD31及VEGF的蛋白表达。样本数均为3。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析及Bonferroni校正。结果单纯微球呈球形,表面疏松多孔;P311微球及FITC-BSA微球表面光滑无孔隙,且FITC-BSA微球散发出均匀的绿色荧光;3种微球直径基本一致,为33.1~37.7μm。在37℃时倾斜状态下,与壳聚糖溶液及单纯温敏水凝胶相比,载微球的2种水凝胶结构更稳定。载微球的2种水凝胶网状结构较壳聚糖溶液、单纯温敏水凝胶更致密,且其横断面可见直径约30μm的微球。伤后15 d内,5组大鼠创面均不同程度愈合,其中载P311微球水凝胶组大鼠创面愈合情况最好。敷贴组、壳聚糖组大鼠伤后5、10、15 d创面愈合率分别为(26.6±2.4)%、(38.5±3.1)%、(50.9±1.5)%,(47.6±2.0)%、(58.5±3.6)%、(66.7±4.1)%,均明显低于载P311微球水凝胶组的(59.3±4.8)%、(87.6±3.2)%、(97.2±1.0)%,P<0.05或P<0.01;单纯水凝胶组大鼠伤后10、15 d及载单纯微球水凝胶组大鼠伤后15 d创面愈合率分别为(76.0±3.3)%、(84.5±3.6)%、(88.0±2.6)%,均明显低于载P311微球水凝胶组(P<0.05)。正常组大鼠正常皮肤中可见表皮、毛囊及皮脂腺,未见CD31和VEGF阳性表达;载P311微球水凝胶组大鼠伤后15 d创面已几乎完全上皮化,创面血管、毛囊、皮脂腺生成及CD31和VEGF阳性表达较其他4组全层皮肤缺损大鼠明显增加,CD31和VEGF蛋白表达均较其余5组大鼠明显增加(P<0.01)。结论载P311微球的温敏壳聚糖水凝胶,可以缓释包载的药物,延长药物作用时间,并通过促进创面血管生成及再上皮化,促进全层皮肤缺损大鼠创面愈合。

活动小行星311P/PANSTARRS的动力学特性分析

311P/PANSTARRS是一颗活动小行星,具有小行星和彗星的双重特征,是中国``天问二号'的探测目标之一.311P/PANSTARRS直径较小,约为400 m,非引力效应可能会对其长期动力学演化产生较大的影响.通过假定不同表面组分,研究了Yarkovsky效应对311P/PANSTARRS轨道演化的影响,讨论了密近交汇、非破坏性碰撞和YORP(Yarkovsky-O'Keefe-Radzievskii-Paddack)效应等非引力效应,计算了小行星与大行星密近交汇及碰撞概率,估计了311P/PANSTARRS达到自转周期分裂极限的时标.模拟结果显示与纯引力模型相比,Yarkovsky效应可能会加快311P/PANSTARRS离开当前共振区域,大约在10Myr以后311P/PANSTARRS会离开当前所在共振带,在表面覆盖风化层的情况下有机会通过v6长期共振成为越火小行星;在考虑YORP效应的情况下,311P/PANSTARRS在2 Myr时标内可达到自转周期分裂极限;在考虑Yarkovsky效应及YORP效应等因素的情况下,311P/PANSTARRS在10 Myr时标内仍可保持其动力学稳定性,且YORP效应不会显著影响其半长径偏移量.