Inhibiting Mechanism of Baculovirus p35 Gene to Apoptosis

We transfected Sf9 cells with an expressing vector p35IE1Neo containing antiapoptotic p35 gene and neomycin-resistant gene (as a selection marker). By G418 screening, we got transformed cells that appeared resistant to G418 and picked one clone named Sf9-35. By hybridization in situ, it was found that p35 gene had integrated into the chromosome of Sf9-35 cells; By using actinomycin D treatment and cellular DNA electrophoresis, Sf9-35 cells were found to resist apoptosis induced by infection of vAcΔp35 deleting p35 gene and actinomycin D treatment; And it was also found that apoptosis induced by viral infection and actinomycin D treatment can only be delayed, but can not be stopped in Sf9-35.

IL-35亚基EBI3、P35对系统性硬化症小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响

目的:研究白细胞介素(IL)-35亚基对系统性硬化症(SSc)小鼠肺部和皮肤炎症及肺纤维化的影响。方法:将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组、SSc模型组、SSc+EB病毒诱导的基因3抗体(SSc+EBI3 mAb)组和SSc+IL-12A P35抗体(SSc+P35 mAb)组,除正常对照组外,其余各组小鼠注射博来霉素构建SSc模型。造模后,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35mAb组分别腹腔注射100μL的EBI3 mAb、P35 mAb。采用苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠皮肤和肺组织炎症病理改变,Masson染色观察肺纤维化程度,免疫组化法检测皮肤和肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-35、IL-6、IL-10水平。结果:与对照组相比,SSc模型组小鼠皮肤厚度增加,肺纤维化评分、皮肤和肺组织炎症评分、血清IL-35水平及皮肤和肺组织α-SMA表达水平均升高,血清IL-10水平降低(均P<0.05)。与SSc模型组比较,SSc+EBI3 mAb组和SSc+P35 mAb组小鼠皮肤厚度增加,血清IL-10水平及皮肤、肺组织α-SMA表达水平升高,血清IL-35水平降低(均P<0.05);SSc+P35 mAb组小鼠肺纤维化评分较SSc模型组升高(P<0.05)。与SSc+EBI3 mAb组相比,SSc+P35 mAb组小鼠血清IL-10水平升高(P<0.05)。结论:IL-35可能通过EBI3和P35亚基抑制SSc小鼠模型皮肤和肺部的纤维化病变,而对炎症无明显作用,P35亚基在肺纤维化中的作用更明显。

粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)p35基因功能的研究

细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）或细胞程序性死亡（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ），最早被定义为一种有秩序、受控制并按某种预定程序发展的生理性自然死亡过程〔１〕。诱导细胞发生凋亡的因素很多，而病毒感染是常见的导致细胞凋亡的重要因素之一。由...

美国白蛾核型多角体病毒p35基因的克隆及序列分析

对美国白蛾核型多角体病毒 (HycuNPV ,Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)p35基因的序列分析表明 :HycuNPVp35编码序列 90 0bp ,编码 2 99氨基酸。同源性分析表明 :HycuNPVp35与BomoNPVT3、AucaNPV、SpliNPV、LeseNPV、HearNPV在核苷酸水平上为 99 9%、 95 7%、 93 6 %、 80 2 %和 87 2 % ,在氨基酸水平上为 99 7%、 90 3%、 77%、 6 4 9%和 73 2 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BomoNPVT3中位的H1 2 2 ,在HycuNPV中被R取代。推测HycuNPVp35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BomoNPVT3p35蛋白的相似。

p35基因对MnCl_2诱导PC12细胞凋亡的作用

目的:探讨p35基因对氯化锰(MnCl2)诱导的PC12细胞凋亡的作用。方法:将p35基因转染PC12细胞得到可稳定表达p35基因的PC12/p35细胞株,使用相差显微镜观察、MTT染色和流式细胞分析等方法检测p35基因对MnCl2诱导的PC12细胞凋亡的作用。结果:p35基因在PC12细胞中的稳定表达可以有效地抑制MnCl2诱导的PC12细胞凋亡。结论:p35基因对MnCl2诱导的PC12细胞具有保护作用。

棉铃虫核型多角体病毒p35基因的PCR扩增和克隆及其在原核细胞中的表达

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ Ａｃ Ｎ Ｐ Ｖ） 凋亡抑制基因ｐ３５ 的合成引物，从棉铃虫核型多角体病毒（ Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ） 基因组中用 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增到了１ｋｂ 片段。采用 Ｐ Ｃ Ｒ－ 双脱氧核苷酸链终止银染法，测定了所扩增到的１ ０１０ｂｐ 全序列，发现其开放阅读框完整，长８９７ｂｐ ，编码２９９ 个氨基酸。用 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ 和 Ｐ Ｒ Ｏ Ｓ Ｉ Ｓ 软件分析发现，此片段与 Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ ｐ３５ 基因同源区核苷酸同源性为９１ ％ ，氨基酸同源性也达８１ ％ ，证明了所扩增的片段是 Ｈａ Ｎ Ｐ Ｖ 的ｐ３５ 基因。为了研究此ｐ３５ 基因的功能及其效应机制，克隆了这一基因并在大肠杆菌细胞中实现了表达。

粘虫核型多角体病毒p35基因抑制细胞凋亡的功能研究

利用去血清方法建立 L s细胞凋亡的实验体系 ,证明 L s NPV p 35基因在 L s细胞中瞬时表达可以抑制L s细胞由于无血清造成的凋亡 .构建了在哺乳动物中高效表达 L s NPV p 35基因的载体 p Rc/ RSV- L p35 ,并导入Vero细胞瞬时表达 ,发现 L s NPV p35基因产物也可以抑制 Vero细胞由于病毒感染造成的凋亡 .用含 L s NPVp35的质粒与 v Ac Anh(Ac NPV p35基因缺失病毒 ) DNA共转染 Sf- 9细胞 ,可以使 v Ac Anh DNA在 Sf- 9细胞中形成多角体 ,并且传代后多角体不扩增 ,表明 L s NPV p35基因与 Ac NPV p 35基因具有功能互补性 .

小鼠神经细胞cdc2类蛋白激酶调节亚基p35^(Nck5a)基因的克隆和鉴定

目的： 获取小鼠神经细胞ｃｄｃ２ 类激酶（Ｎｃｌｋ）调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ，用于构建基因重复性打靶载体。方法： 用噬斑原位杂交法从λＰＳ基因文库中克隆小鼠ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因；用限制性内切酶酶切图谱分析和序列测定进行基因组结构分析。结果： 获得较完整的ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ酶切图谱；该基因由一个外显子组成，长９２４ ｂｐ，编码３０７ 个氨基酸的蛋白质，内含子长２０８ ｂｐ，位于５′端侧翼序列中。测定的序列（－ １ ０８０ 至＋ ９２４ ｂｐ 和＋ ３ ７２１至＋ ４ ２２２ ｂｐ）与已报道的序列基本一致，仅在－ １３５和－ ２９５位各插入一个碱基Ｇ。结论： 得到的ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因组ＤＮＡ 片段长约１１ ｋｂ， 其５′端侧翼序列含有一些已知的调控序列，３′端含有ｐｏｌｙ Ａ 的信号序列。

p35^(Nck5a)基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复，采用常规的分子克隆技术，构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆，细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定，２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复，同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95.1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N14 6、S2 0 2 、E2 0 4 、K2 4 4 ,在BmNPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。

棉铃虫核型多角体病毒凋亡抑制基因对p35基因失活病毒的功能拯救

野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）能感染棉铃虫细胞，不引起细胞凋亡，用ＬａｃＺ基因使ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５插入失活，得到缺陷病毒Ａｃｐ３５Ｚ能迅速引起棉铃虫细胞凋亡，但缺陷病毒本身不能复制。用ＡｃＮＰＶ即早期基因ＩＥ１启动子带动棉铃虫杆状病毒（ＨａＮＰＶ）ｐ３５基因在棉铃虫细胞中瞬时表达，能拯救ｐ３５基因失活病毒Ａｃｐ３５Ｚ复制。通过Ｘ－ｇａｌ显色反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ分别检测到了半乳糖苷酶的活性和ｐ３５基因的表达，证明了所克隆的ＨａＮＰＶｐ３５基因不仅是一个凋亡抑制基因，也是一个与杆状病毒复制相关的基因，它的瞬时表达能支持Ａｃｐ３５Ｚ在棉铃虫细胞中复制。

杆状病毒AcMNPV p35基因的克隆表达及多抗制备

用PCR方法扩增得到苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californic anucleopolyhedrovirus,AcM N-PV)p35基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)上,构建得到重组质粒pET-p35,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达了1条约为55 ku的蛋白带。以Ni2+-NTA偶连抗体检测证明所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化融合蛋白,以纯化的融合蛋白制备多克隆抗体,效价为1/1 024。免疫印迹分析表明,该抗血清能与感染苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。

小鼠神经细胞p35^(nck5a)基因5′非编码区基因表达调控功能初步研究

目的 :观察阿尔茨海默病 (AD)的相关基因 p35 nck5a基因 5′侧翼区指导报告基因表达的能力。方法 :将对本实验室所克隆的 p35 nck5a基因 5′侧翼片段连接于报告基因 β-半乳糖苷酶基因的上游构建表达载体 ,利用体外培养细胞和转基因小鼠实验体系来观察该片段在体内、外基因表达调控的差异。结果 :体外培养细胞中 p35 nck5a基因 5′侧翼序列不具有决定报告基因神经特异性表达的能力 ,但在基因组中整合有相同表达载体的转基因小鼠体内却能够指导报告基因的神经限制性表达。 结论 :这种差异提示进行体内。

家蚕核型多角体病毒山东株p35基因的克隆及序列分析

根据家蚕核型多角体病毒T3株p35基因非编码区序列设计一对特异性引物,应用PCR技术从家蚕核型多角体病毒山东株中扩增得到一条1080bp的片段。测序结果表明,该片段含有p35基因,开放阅读框长900bp,编码299个氨基酸,分子量为34.91kDa,pI=6.4。序列分析表明,BmNPV山东株的p35基因与T3株存在差异。

江西部分地区猪痘病毒PCR检测及P35基因的分析

为了解江西部分地区猪痘病毒(SWPV)的感染及流行情况,从江西省7个地区(市)共36个规模化猪场采集55份疑似猪痘病猪的皮肤痘痂组织,应用PCR方法对其进行猪痘病毒核酸检测,并随机挑选19个PCR产物进行序列测定和P35基因序列分析。结果表明,55份样品中,有44份样品检测为SWPV阳性,阳性率高达80%;所测的19条序列与SWPV参考毒株(登录号:AF410153.1)P35基因核苷酸同源性为96.3%～98.4%,推导的氨基酸同源性为87.5%～88.5%;各序列之间的核苷酸同源性为97.7%～100%,推导的氨基酸序列同源性为98.2%～100%。结果表明江西省部分地区的猪群中存在猪痘病毒感染。

穿透支原体主要外膜蛋白pET20b(+)/p35重组载体的构建、表达及鉴定

目的 构建高表达且稳定的pET2 0b(+ ) /p3 5重载体,能在其中进行诱导高表达并得到纯化的p3 5蛋白。 方法 运用Blast、Pfam等生物信息学手段对穿透支原体(Mpe) p3 5基因序列结构与功能预测,将p3 5基因全长插入原核表达载体pET2 0b(+ )中,在BL2 1StarTM(DE3 )进行诱导表达、用Ni柱纯化,在GSH -GSSH体系中逐渐降低其变性剂的方法复性蛋白,Western -blot进行鉴定。 结果 成功的构建了pET2 0b(+ ) /p3 5重组载体,并能在宿主菌中较高表达;此蛋白以包涵体的形式进行表达。 结论 得到了纯化的p3 5蛋白。

凋亡抑制基因p35对杆状病毒增殖的影响

以野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus,Ac NPV)和多角体基因缺失 (ocu- )的 Ac NPV分别感染 Sf9- 35细胞 ,研究了 p35的稳定表达对杆状病毒增殖的影响 .发现p35基因在 Sf9- 35细胞内组成型表达能够影响野生型 Ac NPV包涵体的形成 ,大幅度提高出芽病毒 (BuddedVirus,BV;即无包涵体病毒粒子 )产量 .

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95 .1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4% ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N1 4 6、S2 0 2 、E2 0 4、K2 44,在Bm NPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。

粉纹夜蛾核型多角体病毒p35基因的克隆与序列分析

粉纹夜蛾核型多角体病毒ｐ３５基因的克隆与序列分析施宪宗１王王旬章龙綮新２代小江曲士芮陈曲侯１庞义（中山大学生物防治国家重点实验室，广州５１０２７５）关键词ＴｎＮＰＶｐ３５基因，序列分析，细胞凋亡目前所知，杆状病毒编码两种阻遏宿主细胞因病毒感染而诱发细...

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．