P40蛋白在大肠杆菌内的表达及初步纯化

To obtain purified P40 protein for the further study on its function.Sequence coding for protein P40 was amplified from whole p40 gene by PCR method and cloned into pGEX\|4tl vector for expression.Expressed protein induced by IPTG was then purified with glutathione agrose by means of affinity chromatography.Results showed that the coding sequence of a new gene we cloned previously could be expressed in E.coli with the form of fusion with GST and the fusion protein existed in inclusion bodies of the bacteria.

棉铃虫核型多角体病毒p40基因序列分析

克隆了棉铃虫 (Helicoverpaarmigera)单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)基因组HindⅢ H、J片段 ,其长度分别为 10kb和 6 .7kb。通过对克隆片段末端测序 ,得到HaSNPVp40基因全序列。p40基因编码区全长 96 6bp ,预计可编码 36 .kD的多肽。HaSNPVp40基因核苷酸序列与HzSNPVp40基因有 98%的相同性。这两种基因与BmNPVp40(GenBank -L33180 )和AcMNPVgp41(GenBank -L2 2 85 8)的氨基酸序列相似性 43%左右 ,但四种蛋白对应于HzSNPVp40、HaSNPVp40的 2 8～ 2 77氨基酸区域 ,同源性高达 6 2 % ,并且存在一个保守的亲水性结构域。进一步将在基因组中相邻的HindⅢ -H、J两片段用BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ四种限制性内切酶进行了分析。

PCR检测贵州遵义地区蝙蝠BDV-P40基因片段及同源性分析

目的探讨贵州遵义地区蝙蝠是否存在博尔纳病毒(BDV)自然感染,分析比较其与国外标准株的同源性。方法采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测82只蝙蝠额颞叶脑组织中BDV-P40基因片段,将阳性扩增产物测序,与国外标准株比较同源性。结果蝙蝠额颞叶脑组织中BDV-P40基因片段阳性率为12.2%(10/82)。贵州遵义地区蝙蝠自然感染的BDV-P40核苷酸序列与标准株Strain V和H1766同源性均为96.2%,与He/80比对同源性为94.9%,所编码的氨基酸无改变。结论贵州遵义地区蝙蝠存在BDV自然感染,该地区BDV-P40核苷酸序列与Strain V和H1766存在高度同源性,人感染BDV可能为动物源性。

重庆地区部分牛和猪外周血博尔纳病病毒自然感染的调查

采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应检测了重庆地区牛和猪各50例外周血单核细胞中博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)p24基因片段,并对其进行BDV p40基因片段的检测以确保结果的可靠性。检出的阳性序列与GenBank中5个国家4个动物种属25例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列的同源性,重建基因系统发生树。结果显示,3例牛和2例猪血标本BDV p24检测呈阳性,阳性率分别为6.00%和4.00%;5例标本BDV p40片段检测均为阳性,其余标本均为阴性;BDVp24扩增产物序列与BDV标准病毒株He/80的同源性为100%,与H1766和Strain V相比,变异程度小,所编码的氨基酸序列亦无变化;从发生树可以看出,5例BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-重庆混合支系。提示,重庆地区牛和猪中可能存在BDV的自然感染,其流行株可能源于外来疫病病原的传入。

博尔纳病病毒感染与精神分裂症关系的初步研究

目的:探讨精神分裂症患者发病与博尔纳病病毒(BDV)感染的关系,分析被BDV感染的精神分裂症患者临床特征。方法:用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测86例精神分裂症患者(病例组)和84例健康体检者(对照组)外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24和BDVp40基因片段,用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,并总结阳性患者的临床特征,病例组采用阳性与阴性症状量表(PANSS)评分。结果:病例组外周血标本BDV p24基因片段检出率11.6%(10/86),BDV p40基因片段检出率14.0%(12/86),拷贝数均>102kb/μl。对照组BDV p24、BDV p40基因片段均为阴性(0%,0/84),两组阳性率差异有统计学意义(P均<0.05)。BDV p24和BDV p40基因片段均为阳性的标本测序后,与BDV标准病毒株V和马源的BDV病毒株H1766序列比较同源性分别为96.35%和98.85%。在4个位点出现基因突变(nt1649 T→C、nt1656 G→A、nt1670 C→T和nt1676 C→T)。该目的基因片段与马源的BDV病毒株亲缘关系最近。BDV阳性患者精神症状主要以幻觉、妄想为主。结论:精神分裂症发病与BDV感染有一定的相关性,BDV阳性患者以阳性精神症状为主要临床特征。

IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlapPCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-TEasy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达;另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000bp)、p35(600bp)、rhIL-12(1600bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达;而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。目的构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlapPCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-TEasy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达;另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000bp)、p35(600bp)、rhIL-12(1600bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达;而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。

绵羊肺炎支原体Y98 P26-P40融合基因的表达及免疫原性

根据猪肺炎支原体(Mycoplasma Hyopneumoniae,Mhp)外膜蛋白P30基因和P46基因序列设计引物,通过PCR克隆了绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)标准株Y98膜蛋白P26基因和P40基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MO P26基因与Mhp P30基因核酸序列同源性为79%,MO P40基因与Mhp P46基因核酸序列同源性为74%。分别将MO P26基因、MO P40基因以及P26-P40融合基因与原核表达载体pET28a连接构建了表达质粒pET28a-P26,pET28a-P40,pET28a-P26-P40,并转化受体菌BL21(DE3)得到重组菌株BL21(DE3)(pET28a-P26),BL21(DE3)(pET28a-P40),BL21(DE3)(pET28a-P26-P40)。经IPTG诱导后SDS-PAGE表明有26 000,40 000和66 000左右的目的条带出现;Western blotting表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性;小鼠免疫试验表明重组菌株BL21(DE3)(pET28a-P26),BL21(DE3)(pET28a-P40),BL21(DE3)(pET28a-P26-P40)表达的蛋白对小鼠的保护率分别为90%,90%和100%;重组菌株BL21(DE3)(pET28a-P26-P40)表达的蛋白对绵羊的保护率为85%。本试验结果为研制绵羊肺炎支原体基因工程疫苗奠定了坚实的基础。

新孢子虫表面抗原P40基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达新孢子虫表面抗原P40基因。方法 PCR扩增新孢子虫表面抗原P40基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-P40,转化入大肠埃希菌Rosseta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒pET-28a-P40经PCR及双酶切鉴定构建正确;表达的重组P40蛋白相对分子质量约为40 000,有效识别鼠抗新孢子虫阳性血清。结论成功在Rosseta(DE3)中表达了新孢子虫表面抗原P40基因,为新孢子虫病疫苗的研制及血清学检测方法的建立奠定了基础。

博尔纳病毒感染与精神分裂症的相关研究

目的 探讨博尔纳病毒（Borna disease virus,BDV）感染与精神分裂症的相关性,分析感染BDV的精神分裂症患者临床特征.方法 采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链式反应方法检测86例精神分裂症患者（患者组）和84名健康体检者（对照组）外周血单个核细胞中BDVp24和BDVp40基因片段,以β-肌动蛋白作为内参照,将BDVp24和BDVp40基因片段均为阳性的标本基因进行测序分析,外周血进行抗BDV抗体滴度测定,对患者的精神症状采用PANSS进行量化评分,并总结阳性患者的临床特征.结果 86例精神分裂症患者中外周血标本BDV p24基因片段阳性检出率11.6％ （10/86）,BDVp40基因片段检出率13.4％ （12/86）,拷贝数均＞10^2 kb/μl.对照组检测BDVp24、BDVp40基因片段均为阴性,两组阳性率比较差异有统计学意义（x^2=9.26,P＜0.05）.对BDV p24和BDVp40基因片段均为阳性的标本测序后,与马源的BDV病毒株亲缘关系最近.阳性标本的精神分裂症患者精神症状主要以幻觉、妄想等阳性症状为主,PANSS量表评分均＞40分.结论 精神分裂症发病与BDV感染有一定的相关性,是否是唯一的相关性还有待进一步研究,BDV感染的精神分裂症患者主要以阳性精神症状为主.