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响应面法优化工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件 被引量:26
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作者 陆燕 梅乐和 +2 位作者 陆悦飞 盛清 姚善泾 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第5期1187-1192,共6页
采用快速有效的数学统计方法对工程菌产细胞色素P450BM3的发酵条件进行了优化.首先利用Plackett-Burman设计从众多影响产P450BM3的因素中筛选出影响较大的4个因素:FeCl3含量、诱导时机、诱导时间和接种量.在此基础上再利用响应面法中的... 采用快速有效的数学统计方法对工程菌产细胞色素P450BM3的发酵条件进行了优化.首先利用Plackett-Burman设计从众多影响产P450BM3的因素中筛选出影响较大的4个因素:FeCl3含量、诱导时机、诱导时间和接种量.在此基础上再利用响应面法中的杂合设计进行优化,通过拟合得到响应曲面函数,获得了最佳的实验条件.在该实验条件下,P450BM3酶活从37.6×10-3U·ml-1提高到57.9×10-3U·ml-1. 展开更多
关键词 优化 p450 bm-3 pLACKETT-BURMAN设计 杂合设计
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定点突变提高细胞色素P450 BM-3吲哚羟基化能力 被引量:4
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作者 张彭湃 胡升 +4 位作者 黄俊 梅乐和 雷引林 金志华 姚善泾 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第9期3331-3337,共7页
为进一步提高细胞色素P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)对吲哚的羟基化能力,根据酶结构与功能的关系,以突变酶E435T为基础,在168位点引入D168L突变,获得了吲哚羟基化能力得到显著提高的突变酶D168L/E435T。突变酶对吲哚的Km为1.72 mol·L... 为进一步提高细胞色素P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)对吲哚的羟基化能力,根据酶结构与功能的关系,以突变酶E435T为基础,在168位点引入D168L突变,获得了吲哚羟基化能力得到显著提高的突变酶D168L/E435T。突变酶对吲哚的Km为1.72 mol·L-1(父本2.09 mol·L-1),转化数(kcat)为28.15min-1(父本4.04min-1),表明D168L定点突变可以略微提高酶对底物的亲和力,但主要的效应是促进了底物的转化速率,这两个效应的综合表现是使酶的催化效率(kcatKm-1)比父本酶提高了8.48倍。此外,产物中副产物靛玉红的比例也降低为1.2%(父本7.3%),这说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更有利于靛蓝的生成。 展开更多
关键词 细胞色素p450 bm-3 定点突变 羟基化 吲哚 靛蓝
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细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造 被引量:3
3
作者 胡升 虞青 +2 位作者 梅乐和 姚善泾 金志华 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第11期2869-2875,共7页
为进一步改造细胞色素P450BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)为父本,在可能影响P450BM-3催化吲哚羟基化区域选择性的D168位点进行定点饱和突变,根据全细胞催... 为进一步改造细胞色素P450BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)为父本,在可能影响P450BM-3催化吲哚羟基化区域选择性的D168位点进行定点饱和突变,根据全细胞催化产物颜色及组成进行筛选,得到了产物组成、酶动力学性质与父本不同的两个突变酶。突变酶D168W的吲哚羟基化产物中90%是靛玉红,而另一个突变酶D168R的产物中87%是靛蓝,产物组成均不同于亲本。在催化吲哚羟基化时,D168W的kcat与父本相当,但Km却是父本的4.8倍,催化活力只有父本的20%;而D168R的kcat是父本的1.9倍,Km是父本的82%,催化活力比父本提高了1.37倍。结果表明,在E435T突变上叠加D168位氨基酸残基突变对酶的催化性质产生了单一位点突变所不具有的协同效应,对酶催化的区域选择性和催化活力都有显著影响,以致改变了催化产物组成。这种基于知识的半理性定向进化方法由于是在关键位点进行突变,因此突变目的性强、突变效果显著。 展开更多
关键词 细胞色素p450 bm-3 定向进化 饱和定点突变
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重组细胞色素P450 BM-3酶的表达条件及初步纯化研究 被引量:2
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作者 黄俊 梅乐和 +2 位作者 钟春龙 邓福华 姚善泾 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期96-100,共5页
对重组细胞色素P450 BM-3基因工程菌的培养条件进行了单因素优化,确定了较佳的P450BM-3培养和表达条件:接种量1%,装液量100 mL/500 mL,发酵培养基加入0.1 mg?L-1FeCl3,OD578达到1.0左右时升温至42℃诱导,诱导时间为5 h.考察了DEAE-Sepha... 对重组细胞色素P450 BM-3基因工程菌的培养条件进行了单因素优化,确定了较佳的P450BM-3培养和表达条件:接种量1%,装液量100 mL/500 mL,发酵培养基加入0.1 mg?L-1FeCl3,OD578达到1.0左右时升温至42℃诱导,诱导时间为5 h.考察了DEAE-Sepharose FF与Resource Q 2种阴离子介质对分离纯化P450 BM-3的影响.结果表明,Resource Q纯化效果优于DEAE-Sepharose FF,通过KTA explorer100对Resource Q分离条件进行了优化,0.3 mol?L-1、0.5 mol?L-1的两步NaCl阶跃洗脱,P450 BM-3纯度较高,活性收率为30.1%,纯化倍数为2.12. 展开更多
关键词 细胞色素p450 bm-3 表达 纯化 离子交换层析
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乳糖诱导剂促进P450 BM-3在大肠杆菌中可溶性表达的研究 被引量:4
5
作者 张彭湃 王松廷 《工业微生物》 CAS CSCD 2016年第4期14-18,共5页
P450 BM-3是一种具有工业化应用潜力的单加氧酶,可催化饱和脂肪酸羟基化。为提高其在大肠杆菌宿主中的可溶性表达水平,采用乳糖作为诱导剂对P450 BM-3的诱导表达条件进行研究。结果发现:在大肠杆菌的OD600达到0.7~1.5时,添加2.0 g/L的... P450 BM-3是一种具有工业化应用潜力的单加氧酶,可催化饱和脂肪酸羟基化。为提高其在大肠杆菌宿主中的可溶性表达水平,采用乳糖作为诱导剂对P450 BM-3的诱导表达条件进行研究。结果发现:在大肠杆菌的OD600达到0.7~1.5时,添加2.0 g/L的乳糖、30℃诱导10 h可获得最佳诱导效果。与IPTG的诱导效果对比发现:采用乳糖作诱导剂时,菌体生物量提高1.09倍,目标蛋白量提升2.13倍,蛋白包涵体的比例则降低至10%。研究结果表明:乳糖可显著提升P450BM-3在大肠杆菌中的重组表达水平,并且能够促进p450 BM-3的可溶性表达。 展开更多
关键词 p450 bm-3 乳糖 IpTG 诱导剂 可溶性表达
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Optimization of fermentation conditions for P450 BM-3 monooxygenase production by hybrid design methodology 被引量:3
6
作者 LU Yan MEI Le-he 《Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology)》 SCIE CAS CSCD 2007年第1期27-32,共6页
Factorial design and response surface techniques were used to design and optimize increasing P450 BM-3 expression in E, coll. Operational conditions for maximum production were determined with twelve parameters under ... Factorial design and response surface techniques were used to design and optimize increasing P450 BM-3 expression in E, coll. Operational conditions for maximum production were determined with twelve parameters under consideration: the concentration of FeCl3, induction at OD578 (optical density measured at 578 nm), induction time and inoculum concentration. Initially, Plackett-Burman (PB) design was used to evaluate the process variables relevant in relation to P450 BM-3 production. Four statistically significant parameters for response were selected and utilized in order to optimize the process. With the 416C model of hybrid design, response surfaces were generated, and P450 BM-3 production was improved to 57.90×10^-3 U/ml by the best combinations of the physicochemical parameters at optimum levels of 0,12 mg/L FeCl3, inoculum concentration of 2.10%, induction at OD578 equal to 1.07, and with 6.05 h of induction. 展开更多
关键词 Optimization p450 bm-3 plackett-Burman pB) design Hybrid design
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饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3
7
作者 李红梅 梅乐和 +1 位作者 URLACHER V B SCHMID R D 《浙江大学学报(工学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2007年第7期1214-1218,共5页
为了进一步获得具有更高活力的细胞色素P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)突变酶,利用饱和突变技术对该突变酶的4个氨基酸位点D168、A225、K434、E435分别进行单一的随机突变,通过对其羟基化吲哚生成靛蓝的催化性能表征,发现P450 BM-3氨基酸... 为了进一步获得具有更高活力的细胞色素P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)突变酶,利用饱和突变技术对该突变酶的4个氨基酸位点D168、A225、K434、E435分别进行单一的随机突变,通过对其羟基化吲哚生成靛蓝的催化性能表征,发现P450 BM-3氨基酸残基的168、434和435位均位于蛋白功能区域,而225位则位于非功能区域,同时发现突变酶D168H具有更高的结合辅酶NADPH的能力,其消耗NADPH的能力几乎是亲本酶的8倍,但生成靛蓝的能力却只是亲本酶的3倍,说明该位点极有可能承担了将电子从黄素单核苷酸(FMN)氧化还原酶区域传递到亚铁血红素区域的任务,在P450 BM-3结构与功能的关系中扮演着重要的角色. 展开更多
关键词 细胞色素p450 bm-3 饱和突变 羟基化吲哚 靛蓝
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催化吲哚生成靛蓝的细胞色素P450BM-3定向进化研究 被引量:14
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作者 李红梅 梅乐和 +1 位作者 URLACHER VLADA SCHMID ROLF D 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第7期630-635,共6页
以催化吲哚产生的靛蓝在630nm处具有特殊的吸收峰为高通量筛选指标,将来源于Bacillusmegaterium的细胞色素P450BM-3单加氧酶的基因序列用易错聚合酶链式反应进行定向进化,通过多轮突变,在原有的能产靛蓝的高活力突变酶的基础上成功获得... 以催化吲哚产生的靛蓝在630nm处具有特殊的吸收峰为高通量筛选指标,将来源于Bacillusmegaterium的细胞色素P450BM-3单加氧酶的基因序列用易错聚合酶链式反应进行定向进化,通过多轮突变,在原有的能产靛蓝的高活力突变酶的基础上成功获得了三个高于亲本酶的突变酶,突变酶的酶活分别是亲本酶的6.6倍(hml001),9.6倍(hml002)和5.3倍(hml003),并对突变酶的动力学参数进行了分析.突变酶DNA测序的结果表明,hml001含有一个有义氨基酸置换I39V,hml002含有三个有义氨基酸置换D168N,A225V,K440N,hml003含有一个有义氨基酸置换E435D,这些突变位点有些远离底物结合部位,有些位于底物结合部位. 展开更多
关键词 细胞色素p450bm-3 定向进化 靛蓝 易错聚合酶链式反应 催化活性
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一个有利于细胞色素P450BM-3催化吲哚合成靛蓝的三位点突变酶:D168L/E435T/V445A 被引量:1
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作者 张彭湃 胡升 +3 位作者 梅乐和 雷引林 金志华 姚善泾 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第4期1374-1380,共7页
为进一步提高P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的能力,在前期获得的突变酶D168L/E435T基础上引入V445A突变,获得突变酶D168L/E435T/V445A,该突变酶与D168L/E435T及V445A相比,对吲哚的亲和力分别降低41.5%及35.8%,转化数(kcat)分别提高1.61倍及... 为进一步提高P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的能力,在前期获得的突变酶D168L/E435T基础上引入V445A突变,获得突变酶D168L/E435T/V445A,该突变酶与D168L/E435T及V445A相比,对吲哚的亲和力分别降低41.5%及35.8%,转化数(kcat)分别提高1.61倍及1.31倍,催化效率(kcatKm-1)分别提高1.53倍及1.47倍;该突变酶对电子的耦合率也提高至24.7%,较D168L/E435T提高39.5%,较V445A提高64.7%,说明该突变酶在电子的利用率上有明显改善;此外,该突变酶催化副产物靛玉红的比例大幅降低,降低为D168L/E435T的41.7%及V445A的30.6%,说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更加有利于靛蓝形成。 展开更多
关键词 生物催化 分子生物学 p450 bm-3 吲哚 羟基化 靛蓝
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定向进化细胞色素P450BM-3的研究 被引量:1
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作者 李红梅 yh +2 位作者 梅乐和 Vlada Urlacher Rolf D.Schmid 《生物加工过程》 CAS CSCD 2006年第1期27-29,34,共4页
以来自于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450BM-3为研究对象,采用随机突变和饱和定点突变定向进化技术对P450BM-3进行改造,通过突变体催化靛蓝显色的特性采用活性琼脂平板分析和96微孔板相结合的高通量筛选成功获得了几个具有更高催化性能的突... 以来自于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450BM-3为研究对象,采用随机突变和饱和定点突变定向进化技术对P450BM-3进行改造,通过突变体催化靛蓝显色的特性采用活性琼脂平板分析和96微孔板相结合的高通量筛选成功获得了几个具有更高催化性能的突变体。 展开更多
关键词 定向进化 细胞色素p450bm-3 靛蓝
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细胞色素P450BM-3热稳定性的半理性改造 被引量:3
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作者 刘晓萌 张彭湃 +6 位作者 胡升 黄俊 梅乐和 姚善泾 金志华 雷引林 王进波 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第5期1138-1144,共7页
为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性,采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B-factor),识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残... 为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性,采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B-factor),识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残基位点G46,然后以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本酶在该位点进行定点饱和突变构建了突变文库,并从饱和突变文库中筛选获得了一个热稳定性得到显著提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)。该突变酶(G46S)的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃;在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍。同时,突变酶的酶学性质也得到明显改善,与亲本相比,突变酶Km降低了22%,kcat提高了90%,催化效率kcat/Km(67.42 L?(mmol?min)-1)比亲本提高了1.48倍。这说明G46位点不仅影响酶的热稳定性,还影响酶对底物的结合与催化性能。G46S突变酶的获得表明,只要采用适当的半理性设计策略对正确的位点进行分子改造,可以在提高酶的热稳定性的同时,保持或甚至提高酶的催化活性。 展开更多
关键词 p450 bm-3 半理性分子改造 热稳定性 温度因子 B-FITTER
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氨基酸突变对细胞色素P45 0BM-3羟基化吲哚能力的影响 被引量:4
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作者 李红梅 梅乐和 高舜晔 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第2期282-287,共6页
利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)(PT)的168和435氨基酸位点分别进行随机突变,根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选,获得了三个高于亲本酶(PT)的突变酶D168H、D168L和E435T。通... 利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)(PT)的168和435氨基酸位点分别进行随机突变,根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选,获得了三个高于亲本酶(PT)的突变酶D168H、D168L和E435T。通过考察突变酶反应动力学参数、电子耦合率、热稳定性、最适pH以及区域专一性的变化情况,发现相对亲本酶而言所有的突变酶对底物吲哚的亲和力和催化效率都得到了不同程度的提高,其中突变酶D168H的kcat值比亲本酶提高了3倍多;突变酶D168H的电子耦合率比亲本酶大约降低了2倍,而突变酶D168L和E435T的电子耦合率却有轻微的提高;所有突变酶均在pH8.2附近表现出最大羟基化吲哚生产靛蓝的能力;突变酶D168H对吲哚的区域选择性得到了提高,主产物靛蓝从亲本酶的72%提高到了93%。另外,热稳定性实验表明:尽管突变酶D168H和D168L的热稳定性较亲本酶有所降低,但活力的大幅度提高并未对酶的热稳定性造成大的伤害。以上所有的结果为了解细胞色素P450 BM-3结构与功能关系提供了有用的信息,同时为进一步定向进化P450BM-3提高其功能特性提供了进化模板。 展开更多
关键词 细胞色素p450 bm-3 饱和定点突变 羟基化吲哚 靛蓝
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生物酶法催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮 被引量:1
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作者 孟飞 俞春娜 +1 位作者 李海峰 谢恬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期194-198,共5页
在体外,利用野生型CYP450BM-3对瓦伦西亚烯进行催化,酶-底物复合物催化NADPH氧化的速率为31±1.0 nmol(nmol P450)-1min-1,但催化产物中没有检测到圆柚酮的生成。突变体R47L/Y51F/F87A与底物复合物催化NADPH氧化的速率高于野生型,为... 在体外,利用野生型CYP450BM-3对瓦伦西亚烯进行催化,酶-底物复合物催化NADPH氧化的速率为31±1.0 nmol(nmol P450)-1min-1,但催化产物中没有检测到圆柚酮的生成。突变体R47L/Y51F/F87A与底物复合物催化NADPH氧化的速率高于野生型,为79±6.5 nmol(nmol P450)-1min-1,并在催化产物中检测到圆柚酮的生成,但其产物选择性较差,圆柚酮的含量仅占总产物的6.8%。与此同时,检测了另一个突变体A74G/F87V/L188Q对瓦伦西亚烯的催化效果,发现其与底物复合物对NADPH的氧化速率与突变体R47L/Y51F/F87A相当,但产物中圆柚酮的比率更高,达8.0%。 展开更多
关键词 圆柚酮 瓦伦西亚烯 细胞色素 p450bm-3突变体 生物催化
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