猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

猪肺炎支原体P46基因的原核表达与间接ELISA方法的建立

猪肺炎支原体是猪喘气病的病原体,本研究选择猪肺炎支原体P46膜蛋白基因亲水区序列进行克隆,并将其内3个编码Trp的TGA突变成TGG,然后再克隆到pET28a(+)载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现了高效表达,表达产物相对分子质量约为31ku,约占菌体总蛋白35%,表达形式为包涵体,通过Western blotting证明表达产物与猪肺炎支原体高免血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的猪肺炎支原体P46重组蛋白经过洗涤、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原用于检测猪血清中猪肺炎支原体抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了rP46-ELISA方法,获得了较好的效果,通过与现有ELISA检测方法的比较,结果表明二者间具有较高的符合率。

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备

P46蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,且与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。制备针对该蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源。本研究取猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠,用大肠杆菌表达的P46蛋白作为筛选抗原制备了2株特异性单克隆抗体1A4和3C11。结果显示,2株单抗ELISA效价最高可达1∶64 000。Western-blot结果表明,2株单抗均能与原核表达的P46蛋白及猪肺炎支原体全菌蛋白中46 000大小的蛋白发生特异性反应;2株杂交瘤细胞株经3个月冻存或连续传代3个月均能保持较高的滴度。本研究成功制备了2株针对猪肺炎支原体P46蛋白的特异、稳定且高滴度的单克隆抗体。

猪肺炎支原体168弱毒株P46基因的克隆和鉴定

猪肺炎支原体的表面抗原基因 Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应，其分子量约４６ ｋ Ｄａ。根据 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 公布的 Ｐ４６基因序列设计１对能扩增 １ ３７７ ｂｐ Ｐ４６结构基因的引物（５： Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ，３： Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ）作 Ｐ Ｃ Ｒ，成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出目的基因。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９质粒中，部分测序表明克隆基因与 Ｊ株基因同源性达９６％ 。其变异主要表现为 Ａ 碱基缺失或变为 Ｃ碱基；人工致弱株外显子基因中 Ａ、 Ｔ 碱基较 Ｇ、 Ｃ可能有更高的易变性。

不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对,分析3种疫苗菌株和4个标准株之间核苷酸及氨基酸差异。结果发现,疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%,与J株、232株相似性为99.1%,与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%;而与疫苗株168株相似性为97.5%;三个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%,差异主要发生在R1区重复序列的次数上。本研究为临床猪支原体肺炎活疫苗菌株的检测及不同菌株之间的差异鉴定研究奠定了基础。

广西陆川猪肺炎支原体P46基因克隆及序列分析

为了解广西陆川猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的主要免疫原性表面蛋白基因P46的序列特征、基本结构及遗传变异等特点，试验以2011至2013年广西纯种陆川猪疑似猪支原体肺炎（MPS）阳性病料为研究对象，抽提DNA进行PCR扩增，将克隆出与目的基因大小相符的片段回收，再与载体连接，转化到大肠杆菌DH5“感受态细胞中，筛选阳性克隆及测序，扩增获得4株Mhp毒株（GXLC1、GXLC2、GXLC3和GXLC4），随后用DNAStar软件对P46基因序列进行比对分析。结果表明，已克隆出的P46基因序列长度为1104bp，编码368个氨基酸，其中该序列中含有3个编码色氨酸的TGA密码子，而不是终止密码子；1个CGG为编码精氨酸的稀有密码子，而不是其他支原体中的无义密码子。所获得的4株Mhp毒株的P46基因序列与所参考的MhpJ株、232株、7448株及168株的核苷酸同源性为98．4％～99．4％，氨基酸同源性为98．6％～99．5％，毒株之间P46基因的同源性很高，保守性较强。

屠宰猪猪肺炎支原体P36、P46、P97 R1、P146氨基酸序列的差异分析

为了解猪肺炎支原体流行菌株遗传变异情况,选取2014-2017年不同时间、地点收集的17头猪肺炎支原体阳性屠宰猪肺脏灌洗液DNA为模板,进行猪肺炎支原体P36(编码具有强免疫原性的胞浆蛋白)、P46(编码具有强免疫原性的表面蛋白)、P97 R1区、P146高变区(猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的重要功能区域)基因的PCR扩增、测序。结合GenBank登录的猪肺炎支原体相关序列进行氨基酸序列的比对分析。结果表明,比对的序列之间,P36、P46蛋白氨基酸序列同源性均在98.9%以上,但P97功能区R1区、P146多变区在菌株间存在较大差异。11个屠宰猪样本和5个GenBank登录菌株P97 R1区重复氨基酸序列数量达到14个以上,而GenBank登录的3个疫苗相关菌株(168株、168-L株、J株)及另外4个菌株、4个屠宰猪样本重复序列为9～11个不等;P146高变区氨基酸序列的差异主要集中在2个重复氨基酸序列区(R1、R2),GenBank登录的168株、168-L株、J株以及另外2个菌株,1个屠宰猪样本在R1区出现较多氨基酸缺失。168株、168-L株,6个屠宰猪样本及另外3个GenBank登录菌株在R2区出现了3～9个不等的氨基酸缺失。利用DNAStar进行抗原表位预测发现,菌株间P97 R1、P146 R1、P146 R2区氨基酸序列的差异,导致了抗原表位出现明显的变化。提示开展P97、P146等黏附因子的筛选和研究或许能进一步提升疫苗阻止猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的作用,从而进一步改善疫苗的免疫效果。

猪肺炎支原体膜蛋白P46基因在大肠杆菌中的表达

把猪肺炎支原体 (Mycoplasmahyopneumoniae) 国际标准株 2 32的P4 6基因克隆进pGEM_T_EASY载体上 ,通过PCR方法把该基因中三个编码Trp的密码子TGA突变为TGG ,然后将该基因亚克隆到载体pMAL_P2X上 ,得到重组表达载体 pMAL_P2X_P4 6。用该重组载体转化大肠杆菌TB1,得到表达重组菌TB1_pMAL_P2XA_P4 6 ,用终浓度为 0 3mM的IPTG在 37℃下诱导表达 ,获得可溶性表达的融合蛋白MBP_P4 6 ,在免疫印迹试验中 ,兔抗MBP高免血清和兔抗猪肺炎支原体高免血清都能与目的蛋白发生阳性反应 ,证明猪肺炎支原体P4 6基因在大肠杆菌里获得了可溶性表达。

猪肺炎支原体表面蛋白P46基因的克隆与序列比较

猪肺炎支原体 (MycoplasmaHyopneumoniae ,Mhp)兔化弱毒株R6 5 9株、济南强毒株、强毒Z株、国际标准株2 32 ,通过A2 6培养基培养 ,提取DNA ;利用PCR技术从四株猪肺炎支原体中均能扩增出目的条带。将该序列克隆到pGEM_T_Easy载体上测序。结果表明 ,克隆序列全长 115 2bp ,编码 383个氨基酸和一个终止子 (TAA) ;该序列中含有 3个TGA编码Trp ,而不是终止密码子。比较兔化弱毒株与济南强毒株、国际标准株 2 32及NCBI上发布的J株的P4 6基因序列 ,发现它们的同源性分别为 98 6 %、99 2 %、99 2 % ;比较它们编码的氨基酸发现它们的同源性分别为 98 7%、99 2 %、99 2 %。结果表明猪肺炎支原体的P4 6基因在猪肺炎支原体种内是很保守的 ,因此建立以P4 6蛋白为诊断抗原的ELISA具有潜在的意义。

猪肺炎支原体MY-99株P46基因的序列分析

提取猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)MY-99株DNA,利用设计的一对引物扩增编码P46蛋白的基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体,挑取2个克隆株测序。测序结果表明,P46基因全长1134 bp,编码378个氨基酸,序列的182、381和734位有3个TGA,是编码色氨酸Trp的密码子。2个克隆株的测序结果与标准株232株的P46基因序列相比,其同源性分别为99.6%和99.2%。

猪肺炎支原体P46基因特异性噬菌体随机肽库的构建

通过构建猪肺炎支原体膜蛋白P46的噬菌体展示肽库,以筛选其特异性抗原表位。用DNase I随机消化法获取P46基因主要抗原序列(不含信号肽的编码序列)的随机片段,片段经与pBamHI Linker连接和BamHI酶切后,克隆到pC89 pⅧ型噬菌粒载体,重组噬菌粒转化感受态细胞XL1-Blue,辅助噬菌体VCSM13超感染,从而构建了P46基因特异性噬菌体随机肽库。结果,所建肽库含有约2.3×104个不同克隆,滴度约为1.3×1014PFU/mL。说明所建肽库具有较大库容和较好的多样性,可满足P46蛋白抗原表位的筛选。

重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基优化和高密度发酵

为提高重组蛋白的生产效率,利用响应面试验设计技术,对表达猪肺炎支原体P46蛋白的重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基进行了优化,确定了培养基各营养成分及其最佳配比。在相同培养条件下,优化培养基比LB培养基的菌体浓度高出一倍。在生物反应器中利用优化培养基发酵培养该重组大肠杆菌,培养物的湿菌重达39.5 g/L。SDS-PAGE电泳结果显示,高密度发酵对重组大肠杆菌DE-pET-P46的rP46的表达和占细胞总蛋白比例均没有明显的改变。

猪肺炎支原体西昌分离株16S rRNA和P46部分基因的克隆与序列分析

为了解西昌猪肺炎支原体的遗传变异情况,对西昌市Mhp分离株XC01的16S rRNA和P46基因部分序列进行PCR扩增和序列分析,并构建NJ树。结果显示,XC01的16S rRNA和P46基因片段的长度分别为1 146 bp和1 059 bp,与Mhp参考株的核苷酸序列同源性分别为97.5%~99.8%和98.6%~99.4%;构建的NJ树显示不同地方的Mhp株未形成明显的地理分支。结果表明,Mhp分离株的16S rRNA和P46基因序列高度保守,在遗传演化中未发生太大的变化。研究结果为猪肺炎支原体的分子遗传变异研究和开展分子流行病学调查提供参考依据。

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清 ,对旋毛虫新生幼虫 c DNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆 p BK- CMV- WN10的序列分析结果表明 ,c DNA全长为 135 2 bp,含有 1个 12 18bp的完整的开放阅读框架 (ORF) ,编码的多肽由 4 0 6个氨基酸残基组成 ,其相对分子质量理论推导值为 4 5 90 0 ,等电点为 5 .4 3,N末端的信号肽及糖基化位点 (NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白 ,氨基酸序列 19～ 15 6与 15 8～ 2 95为重复区域 ,相似性为 74 % ,C末端有 1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域 ,但旋毛虫 p4 6 0 0 0抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异 ,可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。 PCR结果显示 ,从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和 5日龄成虫 c DNA中均扩增出此基因 。

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的 对旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。 方法 利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET 2 8a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析表达产物。 结果 SDS PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 480 0 0 ,与理论值相符。ELISA和Westernblotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 460 0 0蛋白。 结论 成功表达了旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。

猪肺炎支原体P46基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体J株P46基因序列设计一对引物,扩增得到P46全基因序列,将克隆得到的P46基因片段克隆至pEasy-T载体中进行测定。将SC株P46基因与232株、J株、7448株及168株进行比对,结果表明SC株与这些株同源性分别为99.9%、99.6%、99.2%、99.0%。

猪肺炎支原体SC株P46基因的定点突变

猪肺炎支原体P46基因中有3个密码子TGA用于编码Trp而非终止密码子,为了在原核表达系统中进行猪肺炎支原体P46基因的根表达,根据其序列设计了3对引物,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法将编码密码子TGA同义突变为TGG。将突变后的P46基因克隆至pEasy-T载体中,并进行测序。测序结果表明将P46基因中的TGA密码子突变为TGG很成功。

猪肺炎支原体168弱毒株P46-P65融合蛋白的免疫原性

根据猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株p46和p65基因序列设计特异性引物,进行PCR扩增并构建表达载体pET-28a-p46,pET-28a-p65以及pET-28a-p46-p65。以表达载体pET-28a-p46和pET-28a-p46-p65为模板,将其中p46基因3个TGA密码子突变为TGG。原核表达并纯化的蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫小鼠,通过酶联免疫吸附反应(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价。分别选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA试验证明单蛋白P46、P65以及融合蛋白P46-P65的血清效价分别为:1∶1 280000,1∶128 000和1∶2 560 000;攻毒试验证明,P46、P65单蛋白和P46-P65融合蛋白疫苗的保护率分别可达82%,78%和98%。融合蛋白P46-P65具有良好的免疫原性,并且要优于单蛋白P46和P65的免疫原性。

屡损开关管的又一重要原因——兼答P46/8/2001问题4

提示:本文中开关管基极电流的求解方法请参阅本刊连载文章《从电子、家用电器元器件到基本电路(十八)》(P24/12/2000)。一台金星C498—1型彩电出现“三无”故障。经检查发现开关管V720(2SD2294)已击穿,脉宽控制管V725(BC548)集电极虚焊。查电源负载部分无直流短路和开路现象,查开关管集电极尖峰脉冲吸收电路正常。将V725补焊后,又将脉宽控制电容C714(47 μF/25V)和误差取样滤波电容C745(4.7μF/50 V)