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HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测
1
作者
马晶
郭秀婵
+2 位作者
张晓光
张晓梅
曾毅
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第5期364-368,共5页
此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白。首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒。再将该质粒转化到表达菌BL21,...
此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白。首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒。再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白。表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品。纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性。结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性。与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当。该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础。
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关键词
慢病毒属
HIV-1
p66
蛋白
原核表达
活性检测
下载PDF
职称材料
衔接蛋白p66^(Shc) CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达
2
作者
薛珊珊
杜玮
+2 位作者
孙亚楠
李西川
马振毅
《天津医科大学学报》
2012年第4期419-421,共3页
目的:构建可以产生分泌p66ShcCH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子X...
目的:构建可以产生分泌p66ShcCH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因。PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验。结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外感染细胞后产生重组蛋白。结论:成功构建体外可以产生p66ShcCH2结构域的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的CH2多肽和体外鉴定与p66ShcCH2结构域结合的蛋白分子实验奠定基础。
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关键词
p66
SHC
CH2结构域
分泌蛋白
结合分子
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职称材料
线粒体呼吸链与活性氧
被引量:
40
3
作者
刘树森
《生命科学》
CSCD
2008年第4期519-527,共9页
已知有氧真核生物细胞吸收的氧分子绝大部分都是在线粒体呼吸链末端细胞色素氧化酶上通过四步单电子还原生成水。但同时也有1%-2%的氧可在呼吸链中途接受单电子或双电子被部分还原生成超氧(O_2^-·)和过氧化氢(H_2O_2)作为呼吸作用...
已知有氧真核生物细胞吸收的氧分子绝大部分都是在线粒体呼吸链末端细胞色素氧化酶上通过四步单电子还原生成水。但同时也有1%-2%的氧可在呼吸链中途接受单电子或双电子被部分还原生成超氧(O_2^-·)和过氧化氢(H_2O_2)作为呼吸作用的正常代谢产物。此种来源于线粒体呼吸链的O_2^-·和H_2O_2不但在多种病理的氧化损伤中起关键作用,同样它们也是正常生理条件下对多种细胞过程具有基本调控意义的氧还信号。基于Chance实验室约自20世纪70到90年代的早期研究贡献以及20世纪90年代后其他各实验室的研究新进展,我们聚焦于下述四个相关问题的评述和讨论:(1)由于线粒体内膜面积及其含有的呼吸链复合体酶活力远远高出细胞中所有膜系数量和相关酶活力之总和,因而线粒体呼吸链产生的O_2^-·和H_2O_2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源;(2)线粒体呼吸链复合体Ⅲ的Q循环中Q_0位点中半醌自由基(UQH·)已明确是O_2^-·的单电子来源;还原细胞色素C-P66^(SHC)是生成H_2O_2的双电子供体。虽然复合体Ⅰ也是产生线粒体基质内O_2^-·的主要来源,但由于其确切生成位点尚未明确,在in vivo条件下能否产生大量O_2^-·也尚有争议;(3)线粒体呼吸链产生O_2^-·后的分配和跨膜转移涉及其生理病理作用机制和作用靶点等复杂而重要的问题,直到目前尚未意见一致。"质子和O_2^-·循环双回路解偶联模型"整合了目前提出的几种假说的联系点,指出H^+和O_2^-·相互作用生成HO_2·及其跨膜很可能是这一复杂问题的中心环节,并与O_2^-·对"脂肪酸shuttling model"或O_2^-·对"UCPS激活"模型形成了内在的联系;(4)线粒体呼吸形成的ΔP(ΔΨ和ΔpH)能直接控制呼吸链的ROS生成,并以非线性(非欧姆)相关方式通过影响Q循环中的Q_0半醌的氧还态和寿命来调节O_2^-·生成的急速变化,这一发现目前已获多家实验室的证实,业已成为线粒体学界的广泛共识。这样,线粒体呼吸生成的ΔP,除了在ATP合成和离子跨膜转运的经典的生物能量转换中介功能之外,又具有了调控作为细胞氧还信号分子ROS的新功能。线粒体也已不再单纯是细胞的"动力站",业已成为联结线粒体动态结构和功能变化与调节不同细胞事件的多细胞信号级联反应的整合平台。
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关键词
线粒体呼吸链
Q循环Q0半醌自由基
ROS生成与△P呈非线性相关
△ψ和△pH对ROS的控制
ROS分配和跨膜
CYT
C—
p66
^She氧还蛋白
质子驱动力新功能
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职称材料
题名
HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测
1
作者
马晶
郭秀婵
张晓光
张晓梅
曾毅
机构
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
出处
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第5期364-368,共5页
基金
国家"973"计划(2005CB522903)
文摘
此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白。首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒。再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白。表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品。纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性。结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性。与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当。该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础。
关键词
慢病毒属
HIV-1
p66
蛋白
原核表达
活性检测
Keywords
Lentiviruss
HIV-1
p66 protein
prokaryotie expression
bioactivity test
分类号
R373.9 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
衔接蛋白p66^(Shc) CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达
2
作者
薛珊珊
杜玮
孙亚楠
李西川
马振毅
机构
天津医科大学基础医学院免疫学系
天津医科大学生物化学与分子生物学系
出处
《天津医科大学学报》
2012年第4期419-421,共3页
基金
国家自然科学基金资助项目(81071730
81101546
+1 种基金
31071128和91019012)
天津市自然科学基金重点项目(11JCZD-JC18700和11JCZDJC19000)
文摘
目的:构建可以产生分泌p66ShcCH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能。方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域。在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因。PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验。结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外感染细胞后产生重组蛋白。结论:成功构建体外可以产生p66ShcCH2结构域的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的CH2多肽和体外鉴定与p66ShcCH2结构域结合的蛋白分子实验奠定基础。
关键词
p66
SHC
CH2结构域
分泌蛋白
结合分子
Keywords
p66
^ShcCH2 domain
secretory
protein
binding partner
分类号
Q7 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
线粒体呼吸链与活性氧
被引量:
40
3
作者
刘树森
机构
中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室
出处
《生命科学》
CSCD
2008年第4期519-527,共9页
基金
"973"计划(2007CB507400)
国家自科学基金(30470837
30270638)
文摘
已知有氧真核生物细胞吸收的氧分子绝大部分都是在线粒体呼吸链末端细胞色素氧化酶上通过四步单电子还原生成水。但同时也有1%-2%的氧可在呼吸链中途接受单电子或双电子被部分还原生成超氧(O_2^-·)和过氧化氢(H_2O_2)作为呼吸作用的正常代谢产物。此种来源于线粒体呼吸链的O_2^-·和H_2O_2不但在多种病理的氧化损伤中起关键作用,同样它们也是正常生理条件下对多种细胞过程具有基本调控意义的氧还信号。基于Chance实验室约自20世纪70到90年代的早期研究贡献以及20世纪90年代后其他各实验室的研究新进展,我们聚焦于下述四个相关问题的评述和讨论:(1)由于线粒体内膜面积及其含有的呼吸链复合体酶活力远远高出细胞中所有膜系数量和相关酶活力之总和,因而线粒体呼吸链产生的O_2^-·和H_2O_2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源;(2)线粒体呼吸链复合体Ⅲ的Q循环中Q_0位点中半醌自由基(UQH·)已明确是O_2^-·的单电子来源;还原细胞色素C-P66^(SHC)是生成H_2O_2的双电子供体。虽然复合体Ⅰ也是产生线粒体基质内O_2^-·的主要来源,但由于其确切生成位点尚未明确,在in vivo条件下能否产生大量O_2^-·也尚有争议;(3)线粒体呼吸链产生O_2^-·后的分配和跨膜转移涉及其生理病理作用机制和作用靶点等复杂而重要的问题,直到目前尚未意见一致。"质子和O_2^-·循环双回路解偶联模型"整合了目前提出的几种假说的联系点,指出H^+和O_2^-·相互作用生成HO_2·及其跨膜很可能是这一复杂问题的中心环节,并与O_2^-·对"脂肪酸shuttling model"或O_2^-·对"UCPS激活"模型形成了内在的联系;(4)线粒体呼吸形成的ΔP(ΔΨ和ΔpH)能直接控制呼吸链的ROS生成,并以非线性(非欧姆)相关方式通过影响Q循环中的Q_0半醌的氧还态和寿命来调节O_2^-·生成的急速变化,这一发现目前已获多家实验室的证实,业已成为线粒体学界的广泛共识。这样,线粒体呼吸生成的ΔP,除了在ATP合成和离子跨膜转运的经典的生物能量转换中介功能之外,又具有了调控作为细胞氧还信号分子ROS的新功能。线粒体也已不再单纯是细胞的"动力站",业已成为联结线粒体动态结构和功能变化与调节不同细胞事件的多细胞信号级联反应的整合平台。
关键词
线粒体呼吸链
Q循环Q0半醌自由基
ROS生成与△P呈非线性相关
△ψ和△pH对ROS的控制
ROS分配和跨膜
CYT
C—
p66
^She氧还蛋白
质子驱动力新功能
Keywords
mitochondrial respiratory chain
ubisemiquinone in Q0 site of Q cycle
non-ohmic dependence of ROS generation on △P
control of ROS by △ψ and △pH
partition and across membranes of ROS
Cyt c-
p66
^Shc redox
protein
novel function of △P
分类号
Q493.8 [生物学—生理学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测
马晶
郭秀婵
张晓光
张晓梅
曾毅
《病毒学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
0
下载PDF
职称材料
2
衔接蛋白p66^(Shc) CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达
薛珊珊
杜玮
孙亚楠
李西川
马振毅
《天津医科大学学报》
2012
0
下载PDF
职称材料
3
线粒体呼吸链与活性氧
刘树森
《生命科学》
CSCD
2008
40
下载PDF
职称材料
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