KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中synaptopodin、podocin、nephrin、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量升高,P62蛋白表达量、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:KLF4通过激活足细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤,其作用机制可能与调控mTOR/P70S6K信号通路有关。

非瑟酮调节LKB1-AMPK-mTOR-p70S6K通路改善大鼠少弱精子症

目的研究非瑟酮对少弱精子大鼠的睾丸及精子保护作用,并探究其机制。方法构建大鼠少弱精子模型,将大鼠随机分为空白组、模型组、非瑟酮低、中、高剂量治疗组、LKB1激动剂组,每组各10只。ELISA法检测各组卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinising hormone,LH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)、催乳素(prolactin,PRL)水平;流式细胞术检测精子细胞凋亡;HE染色检测大鼠睾丸组织损伤;透射电镜检测精子细胞超微结构;qRT-PCR和Western blot检测LKB1、AMPK、mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表达。结果与空白组相比,模型组和LKB1激动剂组FSH、LH、PRL、T等激素水平明显降低,精子细胞出现凋亡,睾丸损伤严重,LKB1、p-AMPK/AMPK表达明显上调,mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达下调(P<0.05);与模型组相比,不同剂量的非瑟酮治疗后,精子细胞凋亡数明显减少,FSH、LH、PRL、T等激素水平明显上升,LKB1、p-AMPK/AMPK明显下调,mTOR、p-p70S6K/p70S6K明显上调(P<0.05)。结论非瑟酮可有效治疗少弱精症大鼠,其作用机制可能与LKB1-AMPK-mTOR-p70S6K信号通路有关。

胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬的研究

目的:研究胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬,发挥其抗肺癌作用的机制。方法:MTT法检测胡桃醌对A549细胞存活率的影响。透射电镜和细胞自噬染色检测试剂盒(MDC)观察胡桃醌诱导A549细胞自噬。蛋白免疫印迹法检测自噬标志蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ和LC3I蛋白和自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K相关蛋白的表达水平。RT-PCR法检测A549细胞中Beclin-1和LC3ⅡmRNA表达水平。结果:MTT结果表明胡桃醌抑制A549细胞增殖,IC 50=10μmol/L;透射电镜和MDC实验发现胡桃醌可以诱导A549细胞产生自噬;与对照组相比,胡桃醌可以显著增加Beclin-1蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LC3I比值和Beclin-1、LC3ⅡmRNA表达水平(P<0.05,P<0.01);胡桃醌干预后,与对照组相比,Akt、mTOR和p70S6K蛋白的表达水平基本不变,但Akt、mTOR和p70S6K磷酸化蛋白的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:胡桃醌可能通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬。

4E-BP1、p70S6K在RAD001抑制胃癌MKN-28、N-87细胞生长中作用的实验研究

目的:探讨真核起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)、核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶p70S6K在RAD001抑制胃癌MKN-28、N-87细胞生长中的作用。方法:体外培养人胃癌MKN-28、N-87细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术、Western-blot检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布及p70S6k、4E-BP1蛋白表达及磷酸化情况。结果:细胞计数结果显示RAD001作用于胃癌细胞株MKN-28,N-8724h即开始出现对细胞生长的抑制作用,随着作用时间延长至48、72h,抑制作用逐渐增强。流式细胞术结果显示RAD001作用24h后MKN-28、N-87细胞株细胞周期发生改变,停滞在G0～G1期细胞比例增加,在实验中显示细胞系N87对于RAD001作用相对敏感。Western-blot结果显示RAD001作用24h后MKN-28、N-87的4E-BP1和p70S6K表达下降,同时去磷酸化。结论:RAD001是通过抑制mTOR的活性,进而阻断4E-BP1及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节着细胞周期以发挥抑制胃癌细胞生长的作用。

人参皂苷Rb1抗小鼠脑自然衰老及其对mTOR/p70S6K通路的影响

【目的】观察人参皂苷Rb1对小鼠脑组织自然衰老的作用,并探讨mTOR/p70S6K通路在其中的作用。【方法】27只C57/B6雌性小鼠购于中山大学实验动物中心,其中7只3月龄C57/B6雌性小鼠为青年组,20只22月龄C57/B6雌性小鼠为老年组,青年组小鼠予生理盐水(PBS)腹腔注射,老年组小鼠分别予PBS(对照)、低剂量Rb1(10 mg·kg-1·d-1)、高剂量Rb1(20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射。6周后处死小鼠,取脑组织匀浆,检测丙二醛(MDA)含量、单胺氧化酶(MAO)活性,western blot技术检测血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、p-m TOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白表达情况。【结果】与青年小鼠比较,老年对照组小鼠脑组织中的MDA含量增多,MAO活性增加,PAI-1蛋白表达增多,m TOR蛋白、p70S6K蛋白磷酸化水平增加。与老年对照组比较,注射Rb1的两组小鼠脑组织MAO活性,m TOR蛋白、p70S6K蛋白磷酸化水平均降低;此外,高剂量Rb1组MDA含量、PAI-1蛋白的表达降低。【结论】高剂量(20 mg·kg-1·d-1)人参皂苷Rb1可以减轻小鼠脑自然衰老;人参皂苷Rb1的这一抗衰老作用可能与m TOR/p70S6K通路密切相关。

mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

目的研究mTOR/P70S6K信号通路中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其底物激酶(P70S6K)在宫颈癌中的表达及其在宫颈癌发生发展中的作用。方法用RT-PCR和免疫组织化学法检测正常宫颈、宫颈癌中mTOR和P70S6K激酶的表达。结果与正常组织相比,宫颈癌中的mTOR和P70S6K激酶在mRNA及蛋白水平表达均显著增加(P<0.05),且两者的表达具有显著的正相关性(r=0.746,P<0.001)。结论mTOR/P70S6K信号转导通路在介导宫颈癌的发生、发展的过程中起到重要作用。

p-Akt-mTOR-p70S6K信号通路蛋白与卵巢癌临床病理特征及化疗耐药的相关性

目的:研究磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)信号通路中的p-Akt,mTOR和p70S6K 3种蛋白与卵巢癌临床病理特征及化学药物治疗(简称化疗)耐药的关系。方法:采用免疫组织化学方法检测18例卵巢癌化疗耐药和25例化疗敏感组织中p-Akt,mTOR和p70S6K蛋白的表达,分析这些蛋白与卵巢癌临床病理特征及化疗耐药的相关性。结果:p-Akt蛋白在卵巢浆液性癌、黏液性癌和子宫内膜样癌中的表达分别为77.14%,50.00%和66.67%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);在高、中分化和低分化癌中的表达分别为73.33%和75.00%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);在I~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期中的表达分别为18.18%和93.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。mTOR蛋白在卵巢浆液性癌、黏液性癌和子宫内膜样癌中的表达分别为77.14%,100.00%和83.33%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);在高、中分化和低分化癌中的表达分别为80.00%和78.57%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);在I~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期中的表达分别为27.27%和96.88%,差异有统计学意义(P<0.05)。p70S6K蛋白在卵巢浆液性癌、黏液性癌和子宫内膜样癌中的表达分别为80.00%,100.00%和100.00%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);在高、中分化和低分化癌中的表达分别为93.33%和78.57%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);在I~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期中的表达分别为45.45%和96.88%,差异有统计学意义(P<0.05)。p-Akt蛋白在卵巢癌化疗耐药和敏感组织中的表达率分别为88.89%及64.00%;mTOR蛋白在耐药和敏感组织中的表达率分别为94.44%及68.00%;p70S6K蛋白在耐药和敏感组织中的表达率分别为100.00%及72.00%,3种蛋白在耐药组中的表达均高于敏感组(P<0.05)。结论:p-AktmTOR-p70S6K信号通路中的3种蛋白可能参与卵巢癌的侵袭和转移,这3种蛋白的表达上调可能与卵巢癌化疗耐药有关,在临床上可作为预测卵巢癌化疗耐药的标志。

mTOR/P70S6K信号通路在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的:研究mTOR/P70S6K信号通路在肝细胞肝癌(HCC)中的表达,探讨其在HCC发生发展中的作用及意义.方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测20例HCC患者癌组织、癌旁肝组织以及10例正常肝组织中mTOR及P70S6K mRNA表达情况;并分析mTOR及P70S6K mRNA的表达与相关临床参数的关系.结果:mTOR及P70S6K mRNA在HCC组织中的表达水平显著高于在癌旁肝组织和正常肝组织中的表达水平(mTOR mRNA:0.594±0.218vs0.437±0.156,0.594±0.218vs0.383±0.081,均P<0.05;P70S6K mRNA:0.610±0.147vs0.486±0.162,0.610±0.147vs0.440±0.141,均P<0.05).mTOR mRNA和P70S6K mRNA在HCC组织中的表达呈正相关(r=0.548,P=0.012),且两者在癌旁肝组织及正常肝组织中的表达亦正相关性(r=0.607,0.737,P=0.005,0.015).mTOR及P70S6K mRNA在HCC组织中的表达水平与病理分期、门静脉癌栓等明显相关,而与肿瘤直径、血清AFP水平、性别等无明显关系.结论:mTOR/P70S6K信号通路在HCC中特异性激活.mTOR/P70S6K信号通路可能在肝细胞肝癌的发生、发展中起重要作用.

mTOR/p70s6k通路与运动诱导的肌肉蛋白质合成

肌肉运动可以激活一些生长因子,这些生长因子是肌肉蛋白质合成的有力刺激物。mTOR信号转导通路通过增加特异性mRNA的翻译从而在不同水平上控制蛋白质合成,mTOR是被其上游信号PI3K和Akt所激活的,最后在力学负荷过载的情况下激活其效应子p70s6k。运动经由PI3K/Akt/mTOR/p70s6k信号转导通路能有效刺激肌肉合成代谢信号分子的激活。虽然对磷脂酸、整联蛋白的研究已经取得了一定的进展,但是还有一些问题需要进一步研究,特别是其与mTOR信号转导通路的关系。由于不同的运动模式对于mTOR/p70s6k信号通路的影响是不一样的,因此更详细地了解不同运动模型的类型、强度和时间,有利于更好地了解mTOR/p70s6k信号转导通路。

胰岛素抵抗大鼠肌肉中IRS-1、P70S6K的表达

目的应用不同饮食喂养大鼠,测定大鼠产生胰岛素抵抗(IR)的情况,观察大鼠骨骼肌IRS-1、P70S6K的表达及大鼠血清中游离脂肪酸(FFA)和超敏C反应蛋白(hsCRP)的变化。方法4周龄Wistar雄性大鼠40只,随机分为4组,分别以普通饲料、高糖饲料、高脂饲料、高糖高脂饲料喂养大鼠8周后,行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验,对大鼠胰岛素抵抗程度进行评估,应用酶联免疫吸附方法检测大鼠血清中游离脂肪酸及超敏C反应蛋白,分别用Western-Blot、Rt-PCR检测大鼠骨骼肌中的IRS-1、P70S6K。结果高脂饲料、高糖高脂饲料组大鼠产生胰岛素抵抗,普通饲料、高糖饲料组未出现胰岛素抵抗,胰岛素抵抗组大鼠游离脂肪酸及超敏C反应蛋白明显高于非胰岛素抵抗大鼠(P<0.01),IRS-1在胰岛素抵抗组大鼠明显低于非胰岛素抵抗组大鼠、P70S6K在胰岛素抵抗组大鼠明显高于非胰岛素抵抗组大鼠体重。结论高脂饲料、高糖高脂饲料喂养大鼠8周可成功的诱导大鼠产生胰岛素抵抗,胰岛素抵抗的产生可能与肥胖、高游离脂肪酸及炎症反应有关。IRS-1在胰岛素抵抗大鼠中的表达降低,P70S6K升高。

mTOR和p-p70S6K在食管鳞癌组织中蛋白表达的相关性及其临床意义

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其下游关键因子p-p70S6K的表达与食管鳞癌发生、发展及浸润、转移的关系.方法:35例食管癌手术切除标本取自河南省安阳市肿瘤医院.应用免疫组织化学SP法检测35例食管鳞癌组织,15例癌旁不典型增生组织及15例正常食管黏膜组织中mTOR及p-p70S6K蛋白的表达.结果:食管鳞癌组织中mTOR蛋白表达与肿瘤TNM分期密切相关(χ2=9.121,P<0.05);在食管鳞癌癌变过程中,mTOR蛋白在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及癌组织中的表达率依次增高,分别为20%(3/15)、46.7%(7/15)、62.9%(22/35),组间比较有明显差异(χ2=7.767,P<0.05).p-p70S6K蛋白表达与肿瘤的淋巴结转移及TNM分期密切相关(χ2=5.846,4.523;均P<0.05),其在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及癌组织中的表达率依次增高,分别为33.3%(5/15)、73.3%(11/15)、74.3%(26/35),组间比较有明显差异(χ2=8.350,P<0.05),mTOR及p-p70S6K的表达呈正相关关系(γp=0.359,P=0.034).结论:mTOR及p-p70S6K蛋白在食管鳞癌组织中表达显著升高,且二者与食管鳞癌的生物学行为关系密切.提示二者高表达与食管鳞癌的发生、发展有关,可作为食管鳞癌早期诊断和判断预后的辅助指标.

糖肾煎对糖尿病肾病大鼠足细胞自噬及mTOR/P70S6K通路的影响研究

目的:研究糖肾煎对糖尿病肾病大鼠足细胞自噬及mTOR/P70S6K通路的影响。方法:大鼠按照随机数字表法分为空白对照组(6只)及造模组(35只),采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)法建立糖尿病肾病大鼠模型,将造模成功大鼠随机分为模型组,糖肾煎低、中、高剂量组及二甲双胍组。糖肾煎低、中、高剂量组分别按照5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg的剂量灌胃给予大鼠糖肾煎,二甲双胍组按照100 mg/kg灌胃给予大鼠二甲双胍,空白对照组及模型组灌胃给予等剂量生理盐水,所有组别给药1次/d,连续给药16周。使用尿蛋白检测试剂盒测定各组大鼠24 h尿蛋白量;使用全自动生化分析仪测定大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平;使用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定血清肌酐、血清尿素氮水平及肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)水平;苏木精—伊红(HE)染色法检查肾组织病理学变化;免疫荧光法测定足细胞Synaptopodin及LC3水平;免疫印记法(western blotting)检测肾组织p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K蛋白水平。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、24 h尿蛋白量、血清肌酐、血清尿素氮、肾组织MDA水平、肾组织pmTOR/mTOR及p-P70S6K/P70S6K水平显著升高(P<0.05),肾组织SOD及T-AOC水平、足细胞Synaptopodin及LC3荧光强度显著降低(P<0.05);与模型组比较,糖肾煎各剂量组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、24 h尿蛋白量、血清肌酐、血清尿素氮、肾组织MDA水平、肾组织p-mTOR/mTOR及p-P70S6K/P70S6K水平显著降低(P<0.05),肾组织SOD及T-AOC水平、足细胞Synaptopodin及LC3荧光强度显著升高,并呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:糖肾煎能够显著改善糖尿病肾病大鼠肾功能,修复足细胞损伤,调节足细胞自噬水平,其机制可能与调节mTOR/P70S6K通路有关。

P70S6K在Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌中的表达及临床意义

目的检测P70S6K在Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌(renal cell carcinoma associated with Xp11.2 translocation/TFE3 gene fusion,TFE3 RCC)中的表达,探讨其在TFE3 RCC发生、发展中的作用及临床意义。方法采用免疫组化法检测23例确诊的TFE3 RCC、14例肾透明细胞癌(clear cell RCC,CCRCC)和6例乳头状肾细胞癌(papillary RCC,PRCC)组织中P70S6K的表达,观察其表达与三种RCC的关系,同时观察P70S6K表达与TFE3 RCC发生、发展和相关临床病理参数的关系。结果 P70S6K在TFE3 RCC组织中的表达(91.3%)明显高于其在CCRCC组织(64.2%)和PRCC组织中的表达(66.6%),差异有显著性(P<0.05)。P70S6K在TFE3 RCC组织中阳性表达水平的H-score评分值(88.2±9.8)亦显著高于其在CCRCC组织(54.4±7.6)和PRCC组织(43.7±6.2)中阳性表达水平的H-score评分值,差异具有显著性(P<0.05)。P70S6K表达与TFE3 RCC患者年龄、有无淋巴结转移和脉管瘤栓有关,与患者性别、肿瘤直径等临床病理参数无关。结论与CCRCC和PRCC组织相比,TFE3 RCC组织中P70S6K表达显著增高,有助于TFE3 RCC的鉴别诊断。P70S6K在TFE3 RCC组织中高表达,同时提示mTOR信号通道在TFE3 RCC的发生、发展中可能起重要作用。为TFE3 RCC的靶向治疗寻找潜在药物靶点提供一定的理论基础。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264.7细胞自噬

目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blot和透射电子显微镜检测Omp A对RAW264. 7细胞自噬的影响。结果:Omp A可以引起自噬蛋白LC3B-II表达升高,并抑制Akt/mTOR/p70S6K的磷酸化水平;雷帕霉素可以进一步降低mTOR和p70S6K磷酸化,并提高Omp A引起的LC3B-II表达升高。结论:鲍曼不动杆菌Omp A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264. 7细胞自噬。这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌引起自噬的分子机制及找到对抗其感染的新方法提供理论依据。

雷帕霉素对p70S6K-siRNA转染的EC9706细胞增殖的影响

目的:观察雷帕霉素对p70S6K-siRNA转染的人食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖的影响。方法:用p70S6K-siRNA转染EC9706细胞,分别作用24、48 h后,采用RT-PCR和Western blot检测p70S6K mRNA及蛋白的表达情况;收集转染p70S6K-siRNA 24 h和未转染的EC9706细胞,加入0、25、50、100、150、250、500和1 500 nmol/L的雷帕霉素处理48 h,采用MTT法检测细胞存活率。结果:p70S6K-siRNA转染后,EC9706细胞中p70S6K mRNA及蛋白的表达均明显降低(mRNA:F=57.825;蛋白:F p70S6K=268.897,F p-p70S6K=35.584,P均<0.05)。随雷帕霉素浓度的增加,未转染和转染组EC9706细胞存活率均降低;与未转染组相比,转染组细胞存活率更低(F剂量=664.919,F组间=1 958.000,P均<0.05。)结论:p70S6K-siRNA能增强雷帕霉素对EC9706细胞增殖的抑制作用。

PI3K、P70S6K在胰岛素抵抗大鼠脂肪中的表达及其意义

目的测定不同饮食喂养大鼠产生胰岛素抵抗(IR)的情况,观察大鼠脂肪中PI3K、P70S6K的表达及大鼠血清中游离脂肪酸(FFA)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)的变化。方法4周龄Wistar雄性大鼠40只,随机分为4组,分别以普通、高糖、高脂、高糖高脂饲料喂养大鼠8w后,行高胰岛素-正常血糖钳实验,对大鼠IR程度进行评估,应用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中FFA及hs-CRP,分别用原位杂交、Western印迹方法检测大鼠脂肪中的PI3K、P70S6K。结果高脂、高糖高脂饲料组大鼠产生IR,普通、高糖饲料组未出现IR,IR组大鼠FFA及hs-CRP明显高于非IR大鼠(P<0.01),PI3K表达在IR组大鼠明显低于非IR组大鼠、P70S6K的表达在IR组大鼠明显高于非IR组大鼠(P<0.01)。结论高脂、高糖高脂饲料喂养大鼠8w可成功诱导大鼠产生IR,IR的产生可能与肥胖、高FFA及炎症反应有关,PI3K在IR组表达降低,P70S6K升高。

mTOR/p70s6k参与巨核细胞多倍体化调控

目的:研究巨核细胞多倍体细胞周期调控的机制。方法:Western blot分析多倍体细胞模型中mTOR/p70s6k通路信号分子表达和磷酸化修饰位点的变化,流式细胞仪双荧光分析S6K1不同结构域磷酸化位点修饰与细胞周期各时相的关系。结果:诺考达唑诱导的Dami细胞可作为相对同步化的多倍体细胞周期模型,mTOR表达增加及第2448位丝氨酸位点磷酸化,发生在G1期进入S期,S6K1的第421位苏氨酸/第424位丝氨酸位点磷酸化发生在G2/M期。结论:mTOR/S6K1通路参与巨核细胞多倍体细胞周期的调控。

miR-381-3p靶向特异性蛋白1抑制mTOR/p70s6k信号通路调控食管癌细胞的增殖和凋亡

目的探讨miR-381-3p靶向特异性蛋白1(SP1)抑制mTOR/p70s6k信号通路对食管癌细胞的增殖和凋亡调控作用。方法RT-qPCR检测正常食管细胞和食管癌细胞中miR-381-3p与SP1mRNA的表达;利用Lipofectamine 2000将miR-381-3p mimic、miR-control、SP1质粒分别或联合转染进入EC9706细胞,基因预测软件预测miR-381-3p的靶基因,双荧光素酶报告检测靶向关系;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹技术检测Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、p70s6激酶(p70s6k)、p-p70s6k和SP1蛋白表达水平。结果miR-381-3p在食管癌细胞EC9706中低表达(P<0.01),而SP1高表达(P<0.01);miR-381-3p与SP13′UTR区存在结合位点,且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表达;过表达miR-381-3p后,食管癌细胞增殖明显降低(P<0.01),Ki67和PCNA蛋白表达明显下调(P<0.01),细胞凋亡率明显降升高(P<0.01),Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达明显上调(P<0.01),mTOR和p70s6k磷酸化明显减少(P<0.01);而高表达SP1可以逆转miR-381-3p对食管癌细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。抑制mTOR/p70s6k信号通路后,食管癌细胞增殖明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),增殖标记蛋白Ki67表达明显下调(P<0.01),凋亡标记蛋白cleaved caspase-3表达明显上调(P<0.01),而SP1蛋白表达无明显变化。结论miR-381-3p可能通过靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信号通路来抑制食管癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡。

miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制研究

目的探讨miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制。方法采用人宫颈癌HeLa细胞株构建宫颈癌大鼠模型,分为Gg组(宫颈癌大鼠)、Gm组(注射miR-10b-mimics)、Gi组(注射miR-10b-inhibitions)。采用HE染色观察癌组织变化,Western blotting、RT-PCR检测mTOR/P70S6K的mRNA和蛋白表达水平,Transwell检测HeLa细胞的侵袭能力。结果Gg组肿瘤组织出现丰富的血供,界限分明,切面呈鱼肉状,肿瘤细胞大小较为均等;Gm组肿瘤组织中有大量纤维血管形成,肿瘤细胞大小不等,胞浆着色较深;Gi组肿瘤组织中纤维血管较少,胞浆着色稍浅。Western blotting结果显示,mTOR/P70S6K蛋白表达水平为Gm组<Gg组<Gi组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,mTOR/P70S6K mRNA水平为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05),miR-10b mRNA水平为Gi组<Gg组<Gm组(P<0.05)。Transwell结果显示,肿瘤细胞侵袭能力为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05)。结论miR-10b过表达可激活mTOR蛋白,增加P70S6K活性,抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

中药肝复康对肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的干预作用

目的观察中药肝复康含药血清对乙醛刺激的肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的影响,以探讨肝复康抗纤维化的分子生物学机制。方法体外培养大鼠HSC-T6细胞,用肝复康对乙醛刺激的HSCs进行干预,采用RT-PCR法测定HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6K的表达。结果空白对照组肝星状细胞各指标表达量呈相对较低水平,乙醛刺激组细胞Ⅰ型胶原、mTOR、P70S6K和Ⅲ型胶原表达量明显升高(P<0.05),而肝复康干预对于细胞Ⅰ型胶原、mTOR和P70S6K的升高有明显的抑制作用(P<0.01)。结论 mTOR/P70S6K信号通路在HSCs活化过程中起到重要作用,肝复康发挥抗纤维化的作用机制与阻断mTOR/P70S6K信号通路有关。