EFFECTS OF RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE AND ITS COMPONENT "DANSHENSU" ON THE PRODUCTION OF PA, PAI, PGI_2 AND EXPRESSION OF THROMBOMODULIN BY BOVINE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURE

The effects of Radix Salviae Miltiorrhizae and its component 'DANSHENSU' on the production of PA, PAI, PGI_2 and expression of thrombomodulin by cultured bovine endothelial cells were studied. 6-Keto-PGF_(1α) was measured with RIA. PA, PAI and thrombomodulin were measured with chromosenic substrate S2390 and S2238 respectively. The results showed that Radix Salviae Miltiorrhizae could promote PA activity and PGI_2 production by bovine endothelial cell (BEC). It could inhibt activity of PAI secreted by BEC. Its component 'DANSHENSU' had the same effects. In addition, Radix Salviae Miltiorrhizae could also increase thrombomodulin activity on the surface of BEC, but 'DANSHENSU' did not.

基于DGKα-PA信号轴探讨扶正祛邪方对人肺癌H292细胞增殖、迁移的影响

目的探讨扶正祛邪方调节DGKα-PA信号轴对人肺癌H292细胞增殖、迁移的影响及可能机制。方法将H292细胞分为对照组和扶正祛邪方低、中、高浓度组,扶正祛邪方低、中、高浓度组分别予3、6、12 mg/mL扶正祛邪方干预48 h,对照组予等体积培养基常规培养。克隆形成实验观察H292细胞增殖情况,细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞迁移和侵袭情况,ELISA检测细胞磷脂酸(PA)含量,Western blot检测细胞二酰甘油激酶α(DGKα)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT和雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)表达。结果与对照组比较,扶正祛邪方低、中、高浓度组细胞克隆形成数明显减少(P<0.05,P<0.01),细胞迁移率明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.05,P<0.01),细胞PA含量明显减少(P<0.01),DGKα、p-AKT、mTOR蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),且以扶正祛邪方高浓度组抑制作用最明显(P<0.01)。结论扶正祛邪方可能通过DGKα-PA信号轴抑制人肺癌H292细胞增殖、迁移,其机制与抑制下游AKT/mTOR信号通路有关。

苦参碱抑制人卵巢恶性畸胎瘤细胞株PA-1体外增殖的研究

目的探讨苦参碱(matrine,MAT)对人卵巢恶性畸胎瘤细胞株PA-1体外增殖的影响。方法体外培养人卵巢恶性畸胎瘤细胞株PA-1,分组予不同浓度苦参碱作用。MTT法检测0.25、0.50、1.0 mg/mL不同浓度苦参碱对细胞增殖的抑制作用以及药物作用的量效和时效关系;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;半定量RT-PCR检测bcl-2/bax mRNA表达水平的变化。结果MTT法显示药物作用后,细胞有明显的抑制增殖作用,且呈时间依赖性和剂量依赖性;流式细胞仪检测不同浓度的苦参碱作用后PA-1细胞的凋亡率依次上升,并与作用时间正相关;细胞周期结果显示苦参碱对PA-1细胞具有明显的G_1期阻滞作用,且具有剂量依赖性。结论苦参碱能使PA-1细胞bcl-2 mRNA和bax mRNA的比值下调,产生G_1期阻滞,从而调节细胞周期,最终导致PA-1细胞在体外的增殖受到明显抑制。

t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。

PA-MSHA抗肿瘤效应的免疫机制研究

目的研究铜绿假单胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株(pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin,PA-MSHA)处理树突状细胞(dendritic cells,DCs)后对其功能及激活T细胞杀伤肿瘤细胞效应的影响。方法取小鼠骨髓来源的DC,观察PA-MSHA体外处理后对DC表面分子、吞噬功能及T细胞杀伤功能的影响。结果 PA-MSHA处理的DC其表面分子CD40、I-E表达显著上升,吞噬功能显著下降,由DC诱导的活化T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应显著高于对照组。结论 PA-MSHA能有效促进DC成熟并增强抗肿瘤免疫效应。

雷公藤内酯醇对血管内皮细胞移行活性及t-PA蛋白表达的影响

目的研究雷公藤内酯醇(T10)对血管内皮细胞移行活性及组织型纤溶酶原激活物(t-PA)蛋白表达的影响,探讨T10对新生血管的抑制作用。方法体外培养传3代人脐静脉内皮细胞,加入不同质量浓度的T10,观察内皮细胞的移行活性和免疫组织化学染色检测内皮细胞t-PA蛋白表达量。结果T10可抑制内皮细胞的移行活性,使移行距离缩短;减少内皮细胞t-PA蛋白表达,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论T10可抑制内皮细胞移行,减少内皮细胞t-PA蛋白表达,抑制血管生成。

GHRP-scu-PA-32K突变体的构建、表达及纯化产物的部分性质研究

在ｓｃｕＰＡ３２Ｋ 的ｃＤＮＡ分子基础上经定点突变，在Ｎ 端紧接Ｌｅｕ１ 之前引入编码ＧＨＲＰ四肽的寡核苷酸序列（ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＣＣＴ） ，构建了ＧＨＲＰｓｃｕＰＡ３２Ｋ 的突变体ｃＤＮＡ。将它克隆到表达载体ｐＣＭβｎｅｏ 中，与ｐＣＭβｄｈｆｒ 共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－ 细胞。筛选到的稳定表达株在无血清培养基的表达量为５８０ＩＵ／（１０６ 细胞·２４ ｈ） 。经锌离子螯合亲和柱纯化的产物，ＳＤＳＰＡＧＥ显示为单一蛋白条带，分子量为３３ ｋＤ，质谱法测定分子量也为３３ ｋＤ。经血纤维蛋白平板法测定比活为１５０ ０００ ＩＵ／ｍｇ 蛋白。对血纤维蛋白的亲和性，突变体为ｓｃｕＰＡ３２Ｋ 的４－５ 倍。

4-PA对BEL-7402细胞的生长调控和诱导凋亡作用的研究

应用ＭＴＴ、流式细胞术研究了新型肿瘤诱导分化剂４－ ＰＡ 对人肝癌细胞系ＢＥＬ－ ７４０２ 细胞的生长调控、诱导凋亡作用。结果表明： ４ － ＰＡ 对ＢＥＬ－ ７４０２ 细胞增殖抑制的ＩＣ５０ 为４ －９ｍ ｍｏｌ／Ｌ，随着作用时间的增加，ＩＣ５０ 增加。作用效果迅速，在０ ．５ 小时就有效地抑制了细胞增殖，抑制率随４－ ＰＡ 浓度的增加和作用时间的延长而增加，在达到最大抑制率后出现饱和。流式细胞仪对细胞周期和细胞凋亡的分析发现：４ － ＰＡ 对细胞增殖期（Ｓ期、Ｇ２ 期） 有较强的抑制和逆转作用，使细胞群截止在Ｇ１ 期。随着作用时间的延长和４ － ＰＡ 浓度的增加，细胞凋亡的比例增加，凋亡细胞多来自于细胞增殖期（Ｓ 期、Ｇ２ 期） 。诱导凋亡和使细胞截止于细胞静息期是４ － ＰＡ 抑制细胞增殖的主要途径。

Corilagin抗PAF诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

目的研究Corilagin抗血小板活化因子(PAF)损伤人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的保护作用及其机制.方法用PAF损伤HUVEC,采用MTT法测定Corilagin对HUVEC活性的影响;以Fura-2/AM荧光探针负载细胞,用双波长荧光分光光度法测定HUVEC细胞内游离钙离子浓度;用ELISA法测定培养的细胞上清液中t-PA、PAI-1含量的变化.结果1μmol/L的PAF刺激内皮细胞2h后,可明显降低HUVEC的吸光度值,细胞内钙离子浓度升高,PAI-1含量明显升高,t-PA含量无明显变化;50～200μmol/L的Corilagin可升高PAF引起HUVEC吸光度值的降低,呈浓度依赖性显著降低HUVEC内游离钙浓度;Corilagin明显抑制PAF诱导的PAI-1分泌增高,对t-PA水平无明显影响.结论Corilagin对PAF诱导的HUVEC损伤具有保护作用,其机理可能与降低细胞内钙离子浓度、抑制PAI-1产生、调节t-PA/PAI-1平衡密切相关.

凋亡相关蛋白Livin及Caspase-3在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

【目的】探讨凋亡相关蛋白Livin及Caspase-3在膀胱移形细胞癌(BTCC)中的表达及其临床意义。【方法】应用SP免疫组织化学法检测55例膀胱移行细胞癌及10例正常膀胱黏膜组织石蜡切片中Livin和Caspase-3表达的情况,结合临床资料进行分析,并探讨两者相关性。【结果】Livin在膀胱移形细胞癌标本中的表达阳性率为76.4%(42/55),而正常对照组中无一例呈阳性表达;Caspase-3在膀胱移行细胞癌标本中的表达阳性率为32.7%(18/55),与对照组阳性率90%(9/10)相比差异有统计学意义(P<0.05)。Livin的表达与膀胱移行细胞癌的初发和复发显著相关(P<0.05),但与组织学分级、临床病理分期、转移与否、肿瘤数目无关;Caspase-3的表达与膀胱移行细胞癌的初发复发、组织学分级、临床病理分期、转移与否、肿瘤数目均无关。相关性分析表明,膀胱移行细胞癌中的Livin表达与Caspase-3表达呈负相关。【结论】Livin蛋白与膀胱癌的发生和复发有关,可作为BTCC早期诊断和评判术后高复发风险的一项重要指标,且Livin的高表达和Caspase-3蛋白的低表达在膀胱移行细胞癌的发生发展起着重要作用。

膀胱移行细胞癌组织中HPA、VEGF基因的表达及其意义

【目的】研究膀胱移行细胞癌（BTCC）组织中乙酰肝素酶（HPA）及血管内皮细胞生长因子（VEGFmRNA）的表达及其临床意义。【方法】应用RT—PCR技术检测62例BTCC组织中HPAmRNA及VEGF mRNA表达，并以12例正常膀胱组织作对照，分析HPAmRNA表达与肿瘤部分临床、病理学特征的关系，并分析HPA与VEGF表达的相关性。【结果】12例正常膀胱组织未发现HPAmRNA阳性表达，BTCC组织中HPAmRNA阳性表达率为58．06％（36／62）。其表达与肿瘤的病理分级、临床分期、淋巴结转移及复发明显相关。而且，HPA与VEGF二者的表达具有明显相关性（r=0．501，P〈0．01）。【结论]HPAmRNA阳性表达与BTCC侵袭转移密切相关，HPA在BTCC组织中过度表达可能通过释放VEGF促进肿瘤血管生成。

RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法:分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEG-FP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值(HA),观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达65.0%.蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为64.5%和69.6%.半定量RT-PCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%;pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为71.4%和69.3%.而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP+PA的作用最为显著,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%,75.0%和96.9%.结论:NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.

应用Sub-G1法和PA法分析HL-60细胞自发凋亡的周期特异性

分别用Sub G1法和PA法对人类早幼粒细胞急性白血病细胞株 (HL 6 0 )的自发凋亡进行检测 ,发现HL 6 0细胞自发凋亡时 ,在DNA直方图上 ,G1峰前出现亚G1峰 (Sub G1峰 ) ,G1期细胞增加 ,S期和G2 /M期细胞减少。同时G1期细胞发生自发凋亡 ,而S期 ,G1期细胞少有凋亡发生。

海带多糖L01对人脐静脉内皮细胞表达和分泌t-PA的影响

目的:利用人脐静脉内皮细胞体外培养模型,探讨肾上腺素刺激状态下海带多糖L01对内皮细胞的保护作用,以及其对其分泌的组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的影响,从内皮细胞抗血栓功能方面探讨海带多糖L01对心血管系统的保护作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞系ECV-304,用肾上腺素刺激24h、48h、72h采样,ELISA法测定HUVECs培养上清液中的t-PA含量,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测HUVEC细胞内t-PA mRNA的表达,其扩增产物经电泳后密度扫描及半定量分析。结果:肾上腺素模型组HUVECs培养液中t-PA(24h、48h)含量明显增加,;单给海带多糖对HUVECs t-PA分泌无影响。海带多糖L01在肾上腺素刺激下给药24h,48h后t-PA抗原分泌明显降低(P<0.01),且具有一定的量效关系,但HUVECst-PAmRNA表达各组均无明显差异。结论:肾上腺素可刺激内皮细胞分泌t-PA抗原,海带多糖L01对血管内皮具有一定的保护作用,减少肾上腺素刺激下HUVECs分泌t-PA,而对t-PAmRNA表达无明显影响。

电视胸腔镜手术对原发性非小细胞肺癌患者GLU、WBC及PA的影响

目的分析电视胸腔镜手术对原发性非小细胞肺癌患者GLU、WBC及PA的影响。方法选取2013年1~12月在我院接受治疗的98例原发性非小细胞肺癌患者,随机分为对照组和研究组,对照组接受传统开胸肺叶切除术,研究组接受电视胸腔镜手术。比较治疗后两组患者GLU、WBC及PA水平。结果研究组患者切口长度、术后胸腔引流过量的天数、术后住院时间明显低于对照组,差异均具有统计学意义（P〈0.05）;两组术后1 d内该三项指标相差较大,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论电视胸腔镜手术治疗原发性非小细胞肺癌患者术后GLU、WBC及PA变化小,对患者影响更小且其疗效更好,值得临床推广应用。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10^(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)因其在防止血栓形成中起重要作用而受到人们的重视。但由于t-PA在血液中半衰期很短,作为溶栓药,一时难于推广。为了延长半衰期、增强其特异活性,本组构建了t-PA突变体并在CHO-dhfr^-细胞中获得了高效表达。我们在细胞培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定、染色,进行染色体分析,结果表明,t-PA工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒。四倍体、裂隙、断片,畸变率为15％,属于正常范围。同时我们对该细胞系进行成瘤性试验,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以Hela细胞为阳性对照,CHO-dhfr^-细胞为阴性对照,试验表明:t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。

多孔微球固定化CHO工程细胞生产rt-PA的研究

以 Ｃｙｔｏｐｏｒｅ 多孔微球固定产重组组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ Ｐ Ａ） Ｃ Ｈ Ｏ 工程细胞株４ Ｂ３ ，在２ Ｌ 搅拌式生物反应器用无血清培养基 Ｄ Ｆ５ Ｓ 连续灌流培养。４ Ｂ３ 细胞的最大活细胞密度和ｒｔ Ｐ Ａ 生产水平分别达到８８３ ×１０６／ ｍ Ｌ 和１２４７３ Ｉ Ｕ／ ｍ Ｌ。含ｒｔ Ｐ Ａ 的４ Ｂ３ 细胞培养上清经 Ｍ Ｐ Ｇ 吸附层析和 Ｌｙｓｉｎｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ 亲和层析两步纯化，ｒｔ Ｐ Ａ 的纯度达到９８ ％ 。

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。

野生型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞株生物学特性分析

野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10^(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000～5000IU/24h。细胞经体外传代3个月及冻存3个月后复苏,部分亚克隆株表达水平下降,多数仍为10~6细胞4000IU/24h,表明4B3细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的4B3rt-PA均无致瘤性病毒,支原体检查为阴性。遗传特性分析表明,该工程细胞与其亲代细胞CHO-dhfr-细胞染色体数均为20条,均有不同程度不同类型的畸变。该工程细胞的畸变率为16％。CHO-dhfr-细胞畸变率为6％。属正常范围。结果表明4B3细胞株为高效表达的性能优良的工程细胞株。