人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）ｃＤＮＡ，与ｐＵＣ１８重组，经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析，获得全长人ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ．ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ与原核表达载体重组，构建原核表达质粒并转化大肠杆菌．经温度诱导表达，重组ＰＡＩ－２占全菌总蛋白的１４％，以可溶性形式存在，具纤溶抑制活性．工程菌发酵、压榨后，用硫酸铵分级沉淀，沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离，每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质，比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ蛋白质，得率为１９．２％．

非小细胞肺癌中uPA和PAI-2的表达及其临床意义

【目的】探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)及其抑制因子PAI-2蛋白的表达,分析两指标与临床病理学指标的关系。【方法】应用免疫组织化学方法检测108例NSCLC组织中uPA和PAI-2蛋白的表达,分析它们与性别、年龄、肿瘤的大小、癌的组织学类型、组织分化程度、淋巴结转移、手术后总生存期的关系。【结果】108例NSCLC组织uPA和PAI-2的阳性率分别为38.9%和43.5%;uPA的表达在男性组和淋巴结转移组的阳性率分别明显高于女性组和无淋巴结转移组,且随着NSCLC临床分期的升高,uPA的阳性率也明显升高(P<0.05);鳞癌组织中PAI-2的表达明显较腺癌组织中高(P<0.05);uPA和PAI-2的表达均与术后生存期的长短有密切关系。【结论】NSCLC组织中uPA和PAI-2的表达与肿瘤的生物学行为有着密切关系,影响着患者的预后,对uPA和PAI-2蛋白表达的干预,可能可以改变NSCLC的预后。

人胚胎表皮角蛋白细胞分化中PAI-2表达的研究

目的 通过研究人胚胎期表皮分化中PAI 2的表达及变化规律 ,探讨PAI 2与人表皮角蛋白细胞的关系。 方法 用免疫细胞化学及原位杂交技术对早、中、晚期人胚胎表皮角蛋白细胞染色 ,观察PAI 2蛋白及其mRNA原位分布、合成情况 ;用免疫细胞化学及核酸斑点杂交实验检测离体培养的人胚胎表皮角蛋白细胞中PAI 2的表达情况。 结果 PAI 2在人胚胎期主要存在于分化程度高的表皮浅层角蛋白细胞内。胚胎期的表达高峰在胚胎中期 ,胚胎晚期其蛋白水平开始降低 ,而mRNA则维持在相对高位。PAI 2聚集于原位及离体培养的角质蛋白细胞胞浆近胞膜处。 结论 PAI 2可能参与了表皮角蛋白细胞分化的调控。

大肠杆菌表达的重组人PAI-2的纯化及其生物化学特性

目的研究建立大肠杆菌表达的重组人ＰＡＩ－２（ｒｈＰＡＩ－２）的纯化方法，并对ｒｈＰＡＩ－２蛋白进行理化和生物学性质的研究。方法工程菌被高压匀浆后，经硫酸铵分级沉淀，用分子筛、离子交换和疏水性色谱进行分离，得到了ｒｈＰＡＩ－２蛋白。对ｒｈＰＡＩ－２进行了复性，对ｒｈＰＡＩ－２的温度、ｐＨ、盐浓度、氧化剂敏感性、二级速率常数及抗ＳＤＳ复合物形成等理化性质和生物学特性进行了测定。结果每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质，比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ，得率为１９．２％。当温度高至６０℃时，ｒｈＰＡＩ－２迅速失活；当ｐＨ小于３时，ｒｈＰＡＩ－２完全失活；当盐浓度和Ｈ２Ｏ２浓度分别在１．５和０．５ｍｏｌ／Ｌ时，ｒｈＰＡＩ－２的活性仍维持在９０％以上；ｒｈＰＡＩ－２可与尿激酶形成抗ＳＤＳ复合物。结论成功地从大肠杆菌中分离纯化了ｒｈＰＡＩ－２。ｒｈＰＡＩ－２与天然ＰＡＩ－２在理化性质和生物学特性上基本一致。

小鼠表皮角质形成细胞中TNF-α对PAI-2表达的调节

目的 探讨表皮角质形成细胞中TNF α对PAI 2表达的调节及其生物学意义。方法 利用免疫细胞化学、TUNEL反应及免疫细胞化学 TUNEL双标等方法 ,观察TNF α作用下 ,培养的表皮角质形成细胞及其脱落细胞中PAI 2表达的变化及凋亡发生的情况。结果 在TNF α作用下 ,脱落细胞中PAI 2的表达明显增加 ,凋亡细胞的数量增多 ,PAI 2在凋亡细胞中的表达也增强 ,而在一些胞体较大、形态呈多角形的凋亡细胞中PAI 2表达的增加更为明显。结论 在高度分化的表皮角质形成细胞中 ,TNF α可促进PAI 2的表达并可诱导凋亡的产生 ,就与KC凋亡的关系而言 ,TNF α所诱导的PAI 2可分为两种 ,一种与KC凋亡有关 ,另一种与KC凋亡无关。

重组PAI-2基因抑制纤维肉瘤细胞侵袭转移的超微结构研究

目的：研究重组ＰＡＩ－２（纤溶酶原激活剂抑制剂－２）基因在裸鼠皮下纤维肉瘤移植瘤细胞中的表达及其对超微结构的影响。方法：应用常规诊断电镜和免疫电镜技术，观察肿瘤细胞的结构变化，定位研究ＰＡＩ－２蛋白的表达。结果：重组ＰＡＩ－２基因转染的纤维肉瘤细胞，其移植瘤具有ＰＡＩ－２蛋白的表达，以活性形式存在于细胞表面，同时细胞超微结构的恶性特征减弱，分化趋向成熟，侵袭转移能力下降。

PAI-2的两个突变体对TNF-α诱导细胞凋亡的抗性

目的 研究纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)的两种不同突变体抵抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导Hela细胞凋亡的活性差异,探讨PAI-2CD螺旋间区的空间构象对其抗凋亡功能的影响。方法 分别构建突变体PAI-2D和PAI-2M真核表达质粒。转染Hela细胞,RT-PCR鉴定,筛选出能稳定表达PAI-2D和PAI-2M的阳性细胞株。用MTT法检测PAI-2的这两个突变体抗凋亡的活性,并利用计算机同源模建,比较PAI-2的这两个突变体空间构象的变化。结果 突变体PAI-2M能抑制TNF-α诱导的Hela细胞凋亡,而PAI-2D则不能。PAI-2M较好地保持了野生型PAI-2的空间构象,而PAI-2D CD螺旋间区的空间构象则发生了较大的变化。结论 PAI-2抑制TNF-α诱导的细胞凋亡依赖于其CD螺旋间区空间构象的完整性,而与PENF结构域(PENF73～76)无关。

PAI-2在细胞内的定位影响其抗凋亡的活性

目的 为了进一步了解纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在细胞内的定位对其抗凋亡活性的影响。方法 构建绿色荧光蛋白质(EGFP)与PAI-2入核突变体融合蛋白质的表达质粒;转染HeLa细胞,荧光显微镜下比较野生型PAI-2与PAI-2的入核突变体在HeLa细胞内分布的差异;用MTT法检测PAI-2入核突变体抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡的活性。结果 在核定位序列的引导下,几乎所有的PAI-2都进入了细胞核,而野生型PAI-2则弥散分布于HeLa细胞内。MTT法检测发现,当PAI-2被定位于细胞核内时,丧失其抗凋亡的功能。结论 PAI-2在细胞内的定位能影响其抗凋亡的活性,并且当用TNF-α诱导HeLa细胞凋亡时,野生型PAI-2在细胞内的分布没有发生明显的改变。

PAI-2ΔCD突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体基因，实现在大肠杆菌中的表达并建立重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ的分离纯化方法。方法用ＰＣＲ扩增ＰＡＩ－２ΔＣＤ基因，经限制性内切酶片段分析及核苷酸序列分析后，突变体基因与原核表达载体ｐＬＹ－４重组并转化蛋白酶缺陷型菌株ＪＦ１１２５。经温度诱导表达，表达产物用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法和纤溶抑制活性测定等方法鉴定。工程菌发酵后，经高压匀浆破菌，用离子交换、疏水性色谱和分子筛进行分离。结果经温度诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实在相应相对分子质量处出现表达条带，约占全菌总蛋白的１５％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法证实表达产物具有ＰＡＩ－２免疫原性，溶圈抑制法及翻转板法证实表达产物具有纤溶抑制活性。５Ｌ发酵菌液可得湿菌约１００ｇ，经多步纯化后，每升发酵菌液可得纯度达９７％的ＰＡＩ－２ΔＣＤ约３６ｍｇ，比活性为２８６４０ＡＩＵ／ｍｇ。结论成功构建了ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体，实现了在大肠杆菌中的表达，并成功地分离纯化了重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ蛋白。

PAI-2基因多态性与冠心病的相关性研究

目的：探讨PAI-2基因多态性与汉族家族性冠心病的关系。方法：采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）对57例汉族家族性冠心病病人（冠心病组）以及62名汉族无冠心病家族史的健康人（对照组）的PAI-2基因型和等位基因频率分布进行分析，研究它与冠心病的相关性。结果：PAI-2基因Ser／Cys^413（15588位点）G／C多态性等位基因频率在冠心病组和对照组间的分布均有显著性差异（P〈0．05）。Logistic回归分析显示：CC、GG基因型与冠心病相关，且CC是冠心病发病的危险因素（OR=2．405，95％CI：1．059～5．667），GG是冠心病发病的保护性因素（OR：0．303，95％CI：0．089～1．029）。等位基因频率的相对风险分析发现，C等位基因携带者患冠心病的风险是G等位基因的28．88倍（OR=28．88，95％CI：1．96～437．62）。结论：PAI-2基因Ser／Cys^413（15588）G／C多态性与冠心病的发病具有相关性，其中C等位基因是冠心病发病的遗传易感因素，而G等位基因是冠心病发病的保护因素。

正常妊娠妇女和妊娠期高血压疾病患者血浆TAFI和PAI-2变化的研究

目的:探讨凝血酶活化的纤维蛋白溶解抑制物(TAFI)和纤维酶原激活抑制物-2(PAI-2)在正常妊娠妇女和妊娠高血压疾病患者血浆中的变化及其临床意义。方法:研究对象包括22例妊娠期高血压疾病患者(其中子痫前期10例、妊娠期高血压12例)、30例正常妊娠妇女和30例正常未孕妇女,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定研究对象妊娠早、中、晚三期血浆中的TAFI和PAI-2抗原水平。结果:与未孕对照组比较,正常妊娠组妊娠各期PAI-2均明显升高,差异均有显著统计学意义(P均<0.01),而TAFI在孕晚期才明显高于未孕组,差异有统计学意义(P<0.05),与正常妊娠组比较,妊娠期高血压组妊娠三期中TAFI、PAI-2抗原水平差异无统计学意义(P>0.05),子痫前期组妊娠三期TAFI明显高于正常妊娠组,而PAI-2均低于正常妊娠组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TAFI、PAI-2在正常妊娠妇女发挥着纤溶抑制作用,维持母体凝血和纤溶的平衡。TAFI是一个预测子痫前期的敏感指标,有助于预测子痫前期患者血栓前状态的形成,而PAI-2不能用来判断母体内纤溶水平变化,但可能预示不良妊娠结局。两者对于妊娠期高血压患者的临床意义不大。

tPA和PAI-2在兔角膜碱烧伤修复过程中的作用

目的 研究兔角膜碱烧伤后修复过程中 ,组织型纤溶酶原激活剂 (tPA)和 2型纤溶酶原激活剂抑制剂 (PAI 2 )的作用。方法 在构建离体和在体兔角膜碱烧伤模型的基础上 ,采用细胞培养、组织切片、免疫细胞化学以及图象分析等技术。结果 tPA的表达在碱烧伤后 2 4小时左右达到峰值 ,而PAI 2则在伤后4 8小时表达最高 ,离体表达部位位于胞浆 ,并相对靠近胞膜和核膜 ,在体表达部位主要位于角膜上皮层。结论 tPA和PAI

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因，与ｐＰＵＣ１８重组，经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析，获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组，构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒，转化ＧＳ１１５宿主菌，经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆，用甲醇诱导表达，重组ＰＡＩ－２以分泌型表达，占分泌总蛋白的３０％，具ＰＡＩ－２抗原性，与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物，具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．

原位杂交检测骨巨细胞瘤u-PA、u-PAR和PAI-2 mRNA的表达及意义

目的 研究骨巨细胞瘤 (giantcelltumorsofbone,GCT)组织u PA、u PAR和PAI 2mRNA的表达与GCT病理分级和复发的关系。方法 用原位杂交技术检测 42例GCT组织u PA和u PAR和PAI 2mRNA的表达。结果 (1)u PA、u PAR和PAI 2mRNA在GCT组织多核巨细胞 (MGC)的阳性率分别为 6 4.3%、71.4%和 40 .5 % ;单核基质细胞 (MC)的阳性率分别为 5 4.8%、45 .2 %和 9.5 %。 (2 )Ⅱ、Ⅲ级和复发组GCT的MGCu PAmRNA与MCu PA、u PARmRNA的表达率均明显高于Ⅰ级和无复发组 (P均 <0 .0 5 )。 (3)GCT组织两种细胞间的u PAmRNA表达、MGCu PAR与PAI 2mRNA的表达间、MCu PA与u PARmRNA的表达间均呈正相关 ;MGCPAI 2mRNA的阳性率明显高于MC的阳性率(P均 <0 .0 5 )。结论 u PA、u PARmRNA在GCT组织中的表达 ,尤其是在MC中的表达 ,提示肿瘤分化较低和有复发倾向 ;MC可能是GCT中主要的肿瘤细胞。

tPA、PAI-2的生物学特性及其在皮肤角朊细胞分化中的研究进展

综述了tPA、PAI-2的生物学特性及其参与皮肤KC分化的最新进展。

伴高甘油三酯血症的2型糖尿病患者PAI-1活性变化及机制探讨

目的 探讨伴高甘油三酯血症的2型糖尿病患者血浆纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1) 活性变化及机制。方法 对108例2型糖尿病患者和40例健康对照者分别运用等位基因特异性PCR扩增技术测定PAI-1基因启动子区4G/5G多态性, 发色底物法测定血浆PAI-1活性。结果 (1) 伴高甘油三酯血症的2型糖尿病组患者血浆PAI-1活性明显高于单纯糖尿病组及对照组(P<0. 001); (2) 伴高甘油三酯血症的2型糖尿病患者和不伴者的4G/4G、5G/5G基因型频率间差别无显著性意义(P>0 .05); (3)血浆PAI-1活性与4G/5G基因多态性及空腹胰岛素存在显著相关性(P<0. 01); (4) 甘油三酯与PAI-1活性的相关性与基因类型有关, 4G/4G基因型者甘油三酯与PAI-1活性密切相关(r=0.42,P<0. 01), 4G/5G和5G/5G者相关性不明显(P>0 .05)。结论 糖尿病患者PAI-1活性升高是环境和遗传因素共同作用的结果, 高甘油三酯和PAI-1活性的相关性与4G/5G基因多态性有关。

疏血通对2型糖尿病合并冠心病患者血浆PAI-1及D-二聚体作用的临床观察

目的观察疏血通治疗糖尿病合并冠心病血浆纤溶酶原活化物抑制剂-1(PAI-1)及D-二聚体(DD)变化并观察其心绞痛及心电图ST-T的改善。方法将糖尿病合并冠心病患者120例随机分为治疗组60例(在冠心病常规二级预防的基础上加用疏血通治疗14d),对照组(冠心病常规二级预防)60例,分别观察两组治疗前后血浆PAI-1、DD、血浆凝血酶原时间(PT),活化的部分凝血活酶时间(APTT)、国际标准化比值(INR)的变化;心绞痛症状及心电图ST-T改善情况。结果治疗组治疗后PAI-1下降(P<0.05),PT、APTT、INR延长(P<0.05),15例(25%)患者DD值较治疗前升高,但差异无统计学意义(P>0.05),45例(75%)患者较治疗前降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组PAI-1、DD、PT、APTT、INR的变化差异无统计学意义,治疗组心绞痛症状及心电图的ST-T较对照组有明显改善。结论疏血通可安全有效降低2型糖尿病合并冠心病患者血浆PAI-1、DD,延长PT、APTT、INR,并明显改善2型糖尿病合并冠心病患者心绞痛症状及心电图ST-T。

2型糖尿病患者血和尿中t-PA、PAI-1的变化及其临床意义

目的探讨2型糖尿病患者血和尿t-PA及PAI-1浓度的变化,了解它们在糖尿病血管病变中的变化及其临床意义。方法根据尿白蛋白排泄率(UAER)将37例2型糖尿病患者分为两组:正常白蛋白尿组(DM)17例,微量白蛋白尿组(DN)20例。另取正常健康者20例作为对照组。用ELISA法分别检测3组的血浆和尿液t-PA及PAI-1浓度。结果尿液中t-PA浓度在正常白蛋白尿组低于正常对照组(P<0.05);微量白蛋白尿组明显低于正常对照组(P<0.01)。结论尿液中t-PA浓度较血浆浓度更能反映中糖尿病的肾脏血管病变。

罗格列酮对2型糖尿病患者血脂水平和血浆PAI-1活性的影响

目的观察罗格列酮对2型糖尿病患者血脂水平和血浆纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)活性的影响。方法60例2型糖尿病患者随机分为常规治疗组和罗格列酮治疗组,每组30例,另选择20例健康体检者作为正常对照组。常规治疗组和罗格列酮治疗组分别于治疗前和治疗后12周检测空腹血糖(FPG)、血脂水平,采用发光底物法测定全部观察对象的PAI-1的活性。结果治疗12周后罗格列酮治疗组的血清甘油三酯(TG)下降、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)升高,血浆PAI-1活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论罗格列酮可改善糖尿病患者的代谢紊乱,减少血浆PAI-1的表达,有助于改善或延缓糖尿病合并动脉粥样硬化的发生。

血浆PAI-1、胱抑素C与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化的相关性

目的探讨血浆PAI—1、CysC与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化的关系。方法用放射免疫法及生物化学法检测133例患者血浆PAI—1、胱抑素C水平。结果（1）2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化组血浆PAI-1、胱抑素C水平与正常对照组、单纯2型糖尿病组比较差异有统计学意义俨〈0．05）。（2）回归分析显示：PAI-1、CysC与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化独立相关（OR=1．133、1．012E7，P〈0．01）。结论PAI-1、CysC与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化相关，可能成为2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者的预测指标。