基因免疫制备人PAK4单克隆抗体及其部分特性的鉴定

背景与目的:制备人PAK4单克隆抗体可以用于临床诊断恶性肿瘤,同时为深入探讨PAK4蛋白的功能提供可靠途径。材料与方法:用重组PAK4质粒(以P3XFLAG_CMV_10表达质粒为载体)免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠,通过细胞融合与克隆,筛选PAK4特异性单抗。结果:得到稳定分泌PAK4抗体的单克隆杂交瘤细胞2株,分别命名为2D1和3H4;间接ELISA方法测得2株PAK4单抗腹水效价为1∶1.0×104;单抗亚类鉴定表明2D1是IgG类,3H4是IgM类;免疫组化试验显示2株单抗均与临床两例乳腺癌组织管状上皮细胞高度反应。结论:PAK4单克隆抗体特异性较好,可用于临床肿瘤组织诊断。

PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法:针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV。包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9TU.mL-1。将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70%以上。结论:成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。

hPAK4基因重组质粒的构建及蛋白表达

目的构建hPAK4真核表达载体,证实融合蛋白在细胞内表达,融合蛋白可以用于GST-pulldown实验。方法提取人乳腺癌细胞MCF-7mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有GST标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测,同时进行GST-pulldown实验。结果hPAK4全长基因序列克隆到真核表达载体pEBG中,酶切鉴定片段为1800bp。Westernblot检测到融合蛋白GST-hPAK4的表达,分子量约为94kDa,融合蛋白能够被Glutathione Sepharose4B沉淀。结论成功构建了hPAK4全长基因真核表达载体,同时鉴定了GST-hPAK4融合蛋白的表达,并且能够被Glutathione Sepharose4B沉淀。