人禽流感H_5N_1毒株PB1基因突变分析

目的通过对人禽流感H5N1毒株PB1基因序列的变异分析，揭示毒株PB1基因的特征与进化。方法检测广东地区人禽流感H5N1毒株PB1基因核苷酸序列，同时检索全球人禽流感H5N1毒株PB1基因序列，采用DNAStarLa-sergene软件对检索的人禽流感H5N1毒株PB1基因核苷酸序列进行比对和分析，并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析。结果将50株毒株PB1基因核苷酸序列按同源性分成两组：1997-1998年毒株为第1组（G1），2003-2006年毒株为第2组（G2）。PB1基因74个氨基酸发生位点置换，占9．78％（74/757）。PB1基因Ks值为26．1×10^-6～39．8×10～Nt/d，Ka值为3．91×10^-6～5．59×10^-6～Nt/d，检验结果显示，基因进化受到负选择性压力。2003-2006年毒株（G2）丢失G757，引起氨基酸结构改变；同时糖基化位点也较1997-1998年毒株减少了1个糖基化位点NES382-384。结论目前PB1基因进化分成两组，自发突变作用影响PB1基因进化；PB1基因与PB2基因的进化途径在时间特征和区域特征方面类似。2003-2006年毒株PB1基因氨基酸结构和糖基化位点均有改变。

我国鸡源与人源H9N2亚型流感病毒聚合酶PB1基因的关系分析

目的 通过对 1996～ 2 0 0 1年自我国部分养鸡场分离鉴定的 8株H9N2亚型鸡流感病毒聚合酶PB1基因测序 ,了解鸡源与人源H9N2亚型流感病毒聚合酶PB1基因的关系。方法 病毒在鸡胚中传代 ,自收获的尿囊液提取RNA ,通过RT-PCR ,扩增聚合酶PB1基因片段 ,并进行序列测定 ,测序结果采用PHYLIP软件在Internet网上分析处理 ,并用TreeView软件绘制系统进化树。结果 8株H9N2亚型鸡流感病毒聚合酶PB1基因的核苷酸同源性为 97 4 %～ 99 7% ,与三株人源H9N2病毒A/Guangzhou/ 333/ 99、A/HongKong/ 10 73/ 99、A/HongKong/ 10 74 / 99的同源性分别为 90 6 %～ 91 9%、90 4 %～91 5 %、90 2 %～ 91 3%。该 8株鸡源H9N2病毒PB1基因属于相同的进化分支 ,即A/duck/HongKong/Y2 80 / 97-like分支 ,而与该 3株人源株H9N2病毒属于不同的进化分支 ;尚未发现PB1基因属于A/ quail/HongKong/G1/ 97或A/duck/Hong/Y4 39/ 97分支的鸡源分离株。结论 在我国养鸡业流行的H9N2病毒分离株与目前已分离的人源株H9N2病毒其PB1基因属于不同的进化亚分支 ,人源株H9N2病毒PB1基因不是来源于鸡源H9N2病毒。

A型流感病毒中国分离株PB1-F2基因进化分析

【目的】明确国内鸡源H9N2禽流感病毒(AIV)的PB1-F2基因分子进化特征,并进一步全面了解国内A型流感病毒(IAV)流行株的PB1-F2的流行情况。【方法】对分离自北方发病鸡群中的14株H9N2亚型AIV进行了PB1-F2基因的克隆和序列测定,并从GenBank数据库下载了禽源、猪源和人源H5N1和H9N2亚型AIV、人源和猪源H1N1和H3N2IAV的PB1基因共计337个,系统的对国内不同宿主来源的IAV的PB1-F2基因进行了分子进化分析。【结果】上述IAV的PB1-F2基因形成了6个不同的进化分支。推导的PB1-F2蛋白表现出长度的多态性,因IAV的HA类型和宿主来源的不同,其表达功能性PB1-F2蛋白的比率也存在差异。【结论】本研究明确了国内IAV的PB1-F2基因的系统进化特征,为该基因功能的研究提供了分子流行病学资料。

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因测序及进化分析

通过RT-PCR技术对禽流感病毒新疆株A/Duck/X J/4（H5N1）的PB1、PB2和PA基因分别进行了扩增及克隆，测序结果表明该毒株的PB2、PB1和PA基因全长核苷酸序列分别为2341 bp、2282 bp和2187 bp。同源性分析表明A/Duck/X J/4（H5N1）株与禽源、野生鸟类和猪源的禽流感毒株均有很高的同源性（86.3%-99.6%）。与人源毒株相比，PB2和PA与A/HK/156/97（H5N1）株的同源性较低（86.3%-88.7%）;与A/V ietnam/CL01/2004（H5N1）株和A/hum an/Zhejiang/16/2006（H5N1）株的同源性较高（93.0%-98.8%）;PB1与人源毒株A/HK/156/97（H5N1）、A/V ietnam/CL01/2004（H5N1）、A/hum an/Zhejiang/16/2006（H5N1）同源性为91.1%-93.2%。

H3亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因的序列分析

目的阐明H3亚型鸭流感病毒与其他亚型流感病毒的关系。方法对活禽市场分离的3株H3N8亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因进行了序列分析。结果3株鸭源H3N8流感病毒聚合酶PB1基因核苷酸同源性为99．9％，与H9N2亚型流感病毒（DK／ST／2143100）的同源性为96．31％-96．44％，而与H3N8亚型鸭流感病毒（Mal／Alberta／279／98）为88．65％-88．79％。系统进化树分析表明，本实验中的3株病毒属于相同的分支，且与刖duck／HongKong／Y439为代表的H9N2亚型禽流感病毒位于一进化分支，说明三株H3N8亚型流感病毒重排了H9N2亚型禽流感病毒的基因片段。结论不同亚型禽流感病毒在贮存宿主体内的重排以及重排病毒的新特点如鸭H3N8亚型流感病毒对禽的致病性，应当引起我们的高度重视。

A型流感病毒H7N9株PB1和PB2基因的克隆和真核表达

【目的】本试验旨在构建A型H7N9流感病毒RNA聚合酶类蛋白PB1和PB2真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。【方法】首先提取苏州分离株A型H7N9流感病毒的总RNA,通过RT-PCR技术获得了A型H7N9流感病毒PB1和PB2的全长基因,然后将其克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-Flag-PB1/PB2真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定PB1/PB2蛋白的表达。【结果】成功克隆了PB1和PB2全长基因,构建了A型H7N9流感病毒PB1和PB2蛋白真核表达载体pRK-Flag-PB1/PB2,并在293T细胞中转染表达,Western blot确定了PB1/PB2蛋白的成功表达。【结论】该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达PB1和PB2蛋白,为后期开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用的研究奠定了基础。

1968-2014年中国甲型H3N2流感病毒PB1基因进化分析

【目的】分析季节性H3N2流感病毒PB1基因序列的变异情况,揭示H3N2流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势。【方法】对1968-2014年中国地区82株人H3N2毒株、2012-2014年江苏省分离的81株甲型H3N2流感病毒、6株SIV和4株AIV H3N2亚型PB1、PB1-F2基因进行分子进化分析。【结果】1968-2014年中国H3N2流感毒株PB1核苷酸和氨基酸相似性分别为90.91%-100%和96.91%-100%。系统进化树分析,1968-2014年共173株H3N2流感病毒总体上分为4个分支,2002-2014年分离毒株位于第IV分支上,1968-1994年分离毒株位于第II和III分支;猪源H3N2亚型分布于第I、II、IV分支上;分子特征显示PB1氨基酸52、113、179、216、576、586、619、621、709位在2002年以后发生适应性改变,替换了原来的氨基酸;PB1-F2基因编码截断型蛋白长度有52、34、25、24、11 aa(猪源),PB1-F2蛋白毒力关键位点上未出现高致病性特征突变。【结论】自1968年起H3N2亚型PB1基因变异逐步趋于稳定,且PB1-F2截断型毒株正逐渐成为一类新的进化特征,但PB1基因与其他亚型之间发生重配以及关键毒力位点的变异仍应是监测的重点。

深圳H7N9流感病毒PB1-F2基因分子特征

目的了解深圳20株H7N9流感病毒PB1-F2基因的分子特征。方法使用DNAstar、MEGA等生物软件对深圳地区H7N9流感病毒PB1-F2进行核苷酸、氨基酸序列同源性和系统进化分析。结果2014年底到2015年H7N9流感病毒爆发主要集中在广东省，以深圳居首。深圳20株H7N9流感病毒PB1-F2基因主要分为三个亚系。3株的PB1-F2基因的N端缺失编码52个氨基酸；1株PB1-F2基因的c端缺失编码57个氨基酸；1株PB1-F2基因的c端缺编码76个氨基酸；其余株PB1-F2基因编码90个氮基酸。各深圳株与A／Anhui／1-DEWH730／2013株相比核苷酸和氨基酸的同源性分别为96．0％-100％和89．O％～100％。各深圳株之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为94．9％～100％和85．7％～100％。结论深圳H7N9流感病毒PB1-F2基因具有独特的分子特征。

野禽源AIV PB1-F2基因的遗传进化及部分氨基酸位点组成分析

在完成14株野禽源AIV PB1-F2基因克隆、测序的基础上,对其进行了同源性、遗传进化关系及氨基酸编码特征的比较分析。结果发现,H5N1亚型高致病性毒株A/lesser_kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)PB1-F2的第37,48,50位氨基酸分别为精氨酸、脯氨酸、甘氨酸,与其他13个低致病性毒株均不相同(其分别为谷氨酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸)。为探讨这一现象,从NCBI Influenza Virus Resource中选取1 061个AIV毒株的PB1-F2基因序列进一步展开分析,结果表明:在第37,48,50位氨基酸位点上,97香港H5N1、其他H5N1及其他亚型AIV在此3个位点上氨基酸的构成存在着较为明显的差异,而且还呈现出了一定的规律和特点;并且研究还发现在此3个位点上,H9N2亚型毒株也表现出了较强的时间和空间分布特征。针对PB1-F2基因的遗传进化关系分析表明,H5N1及香港系毒株较其他AIV存在较远的遗传距离。随机的突变和重组似乎不足以解释这种差异及遗传距离形成的原因,其生物学意义有待于进一步探讨。

广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2基因进化和变异分析

比较和分析2009～2011年广州地区分离到的甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因和世界各地甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因的变异情况,为该蛋白的功能和作用机制奠定基础。对分离自中国广州地区2009～2011年人类感染的17株新型H1N1和1株季节性H1N1流感病毒进行了PB1-F2基因克隆和序列测定,通过与GenBank数据库中68株人类新型H1N1和季节性H1N1流感病毒参考株的PB1-F2基因进行比对。结果表明,甲型流感病毒的PB1-F2基因进化树形成了2个不同的进化分支。全部2009～2011年新型H1N1流感病毒为一分支。广州地区PB1-F2基因与其它地区分离到的新型H1N1流感病毒具有高度的同源性,均为截短型变异。本实验室分离的1株季节性H1N1流感病毒也发生了第12位氨基酸截短突变。广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2截短蛋白与其它地区病毒相比未发生氨基酸变异,季节性H1N1流感病毒发现类似新型H1N1流感病毒PB1-F2的截短变异,提示新型H1N1流感病毒和季节性H1N1流感病毒PB1-F2可能发生早期重组。