Effects of chimeric intron on the epithelial-mesenchymal transformation of non-small cell lung cancer PC-9

Objective:To investigate the effects of Intron on the EMT capability of non-small cell lung cancer cell line PC-9.Methods:Firstly,using the psiCHECK-2 plasmid as a basic framework to construct the recombinant plasmid of psiCHECK-2-Intron dual-luciferase reporter gene;secondly,the psiCHECK-2-Intron and psiCHECK-2 were transfected into PC-9 cells respectively.The migration and invasion abilities of PC-9 cells were analyzed by Matrigel assay.The expression changes of EMT related hallmarks,including N-cadherin,β-catenin and snail,were detected by qRT-PCR and Western Blotting.Results:Compared with the control group,the migration and invasion abilities of PC-9 cells in Intron group significantly decreased(p<0.001).The expression of N-cadherin,β-catenin and snail also down-regulated(p<0.001).Conclusion:The introns could inhibit the EMT of PC-9 cells.

lncRNA NEAT1通过抑制DNA损伤促进肺腺癌PC-9细胞的增殖

目的:研究长链非编码RNA核富集转录体1(lncRNA NEAT1)对肺腺癌PC-9细胞增殖能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法:qPCR检测人肺腺癌PC-9细胞与人胚肺二倍体2BS细胞中lncRNA NEAT1的表达水平;设计并合成lncRNA NEAT1的小干扰RNA(siRNA)序列,采用脂质体法转染PC-9细胞,通过qPCR检测转染前后PC-9细胞NEAT1的表达水平。MTT法、流式细胞术分别检测lncRNA NEAT1敲低对PC-9细胞增殖及细胞周期的影响;WB检测转染前后DNA损伤相关蛋白,即共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)和双链DNA损伤标志物γ-H2AX的表达水平。结果:与2BS细胞相比,PC-9细胞中lncRNA NEAT1呈高表达(P<0.05)。成功建立NEAT1敲低的PC-9细胞,转染siRNA 12 h后siNEAT1-1及siNEAT1-2干扰组细胞增殖能力较空白对照组及空转染组明显下降(P<0.05);干扰组细胞周期被阻滞在G1期[(88.97±2.64)%(,88.15±1.48)%vs(84.5±1.72)%,P<0.05]和G2/M期[(8.35±2.02)%,(8.11±1.36)%vs(4.28±1.28)%,P<0.05];干扰组细胞中DNA损伤相关蛋白ATM和γ-H2AX表达水平显著升高(均P<0.05)。结论:lncRNA NETA1在肺腺癌PC-9细胞呈高表达,其可通过抑制DNA损伤导致细胞周期G1/M期转变促进肺腺癌细胞PC-9的增殖能力。

CXCR4/SDF-1轴调节人肺腺癌PC-9细胞对Bends细胞血脑屏障模型功能的影响

目的:通过建立体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型,探讨人肺腺癌PC-9细胞在CXCR4/SDF-1轴作用下对BBB紧密连接蛋白的影响。方法:利用永生化的小鼠脑微血管内皮细胞Bends进行单层培养,建立体外BBB模型;通过跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)测定及荧光素钠通透性实验判定体外BBB模型的功能状态以及观察PC-9细胞对体外BBB模型功能的影响。Western blotting检测PC-9细胞在CXCR4抑制剂AMD3100、SDF-1单独或联合(1μg/ml AMD3100,100 ng/ml SDF-1,AMD3100+SDF-1)作用下对BBB模型功能和内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响,Transwell迁移实验检测CXCR4/SDF-1轴对PC-9细胞跨BBB模型细胞层迁移能力的影响。结果:Bends细胞单层培养可形成紧密连接的"屏障"并产生较高的TEER,第96 h达到(182.13±5.19)Ω·cm^2;同时行荧光色钠通透性实验结果显示,BBB具有良好屏障性能,其通透率低于空白对照组(P<0.05)。PC-9细胞作用后,BBB模型TEER逐渐降低,第24 h降至(46.7±4.35)Ω·cm^2;同时BBB通透率较作用前显著提高(P<0.05)。PC-9细胞在AMD3100作用下能够上调内皮细胞紧密连接蛋白的表达(P<0.05);AMD3100处理组的PC-9细胞穿过BBB的细胞数较空白组明显减少[(43±2)vs(81±2)个,P<0.05]。结论:AMD3100能够减弱PC-9细胞对Bends细胞建立的体外BBB模型紧密连接的破坏能力。

Delicaflavone通过PI3K/AKT/mTOR通路调控上皮-间质转化抑制吉非替尼耐药肺癌PC-9/GR细胞迁移和侵袭

目的:研究Delicaflavone对人吉非替尼耐药肺癌PC-9/GR细胞迁移与侵袭作用及机制。方法:采用MTT法检测Delicaflavone对PC-9/GR细胞存活率的影响;采用细胞划痕实验和Transwell实验测定Delicaflavone对PC-9/GR细胞迁移和侵袭能力的影响;采用Western blotting法检测Delicaflavone对PC-9/GR细胞基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)、钙黏连蛋白(E-cadherin,N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达情况。结果:与对照组比较,20 mg/L Delicaflavone作用24 h能显著抑制PC-9/GR细胞的细胞活性(P<0.05),而浓度在10 mg/L以下时则对细胞活性无明显影响。Delicaflavone能够浓度依赖性地抑制PC-9/GR细胞的迁移率、侵袭细胞数量(P<0.05和P<0.01),并能浓度依赖性地减少PC-9/GR细胞迁移标记蛋白(MMP-9和MMP-2)的表达(P<0.01),上调E-cadherin、下调N-cadherin和Vimentin的表达(P<0.01)。此外,Delicaflavone还浓度依赖性地减少p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达(P<0.01)。结论:Delicaflavone具有抑制PC-9/GR细胞迁移及侵袭能力的作用,该作用与Delicaflavone通过PI3K/Akt/mTOR通路调控上皮-间质转化有关。

沉默FGL1增强人肺腺癌PC-9细胞对多西他赛敏感性的研究

目的探讨沉默纤维蛋白原样蛋白1(fibrinogen-like protein 1,FGL1)对人肺腺癌PC-9细胞多西他赛敏感性的影响。方法Western blot法检测人正常支气管上皮细胞株BEAS-2B及人肺腺癌细胞株PC-9中的FGL1蛋白表达情况。以siRNA沉默PC-9细胞株中FGL1基因,CCK-8法检测沉默FGL1对PC-9细胞增殖的抑制作用及对多西他赛敏感性的影响。结果与BEAS-2B细胞株比较,FGL1在PC9细胞株中呈高表达,其蛋白相对表达量是BEAS-2B细胞株的6.5倍,差异具有显著性(P<0.01)。通过转染FGL1siRNA沉默FGL1可增强多西他赛对PC-9细胞增殖的抑制作用。与FGL1siNC组细胞相比,FGL1siRNA组PC-9细胞的IC50值明显降低,差异具有显著性(P<0.01)。结论特异性沉默FGL1基因可抑制人肺腺癌细胞PC-9中FGL1的表达,抑制PC-9细胞的增殖,提高对多西他赛的敏感性。

Cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响

目的研究cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法体外培养的PC-3细胞应用cyclopamine处理后,通过MTT测定细胞增殖抑制情况;电镜下观察肿瘤组织形态学变化;流式细胞仪检测凋亡率;Western印迹技术检测Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白的表达变化。结果MTT法结果显示4μmol/L,8μmol/L及12μmol/L浓度的cyclopamine对PC-3细胞增殖有显著抑制作用,与对照组相比差异有显著性(P<0.05或P<0.01),抑制效果都随着浓度的增大及时间的增加而增强。电镜下可观察到典型的凋亡细胞;流式细胞仪检测结果表明cyclopamine诱导PC-3细胞发生凋亡;Western印迹技术的结果:经培养72h后,随着药物浓度增大,Bcl-2蛋白表达呈逐渐减少,而Bax,有活性的caspase-9蛋白表达逐渐增多。结论Cyclopamine抑制PC-3细胞增殖,在一定剂量和时间范围内呈时间、浓度依赖关系,并可诱导其凋亡。Cyclopamine诱导PC-3细胞凋亡可能通过Bcl-2,Bax,caspase-9介导。

Caspase-3和Caspase-9在PC-12细胞移植肿瘤模型中的表达及意义

为了在建立的PC-12细胞肿瘤移植模型基础上,对不同时间点肿瘤组织中的Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测,探讨Caspase-3和Caspase-9在肿瘤发展过程中的作用和意义,试验将指数生长期的PC-12细胞以0.1 m L(1×107个/m L)的密度接种于出生第7天的昆明白小鼠右前肢腋窝皮下,在接种后的不同时间点(7,14,21天)分别进行取材,将肿瘤块及邻近组织一并取下,通过多聚甲醛固定、包埋剂包埋后进行冰冻切片,采用荧光免疫组织化学法对Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测。结果表明:刚出生7天的昆明白小鼠,接种PC-12细胞后7天时便可以明显观察到肿瘤块的形成,在14天时肿瘤块最大,21天时肿块减小,到28天时肿瘤块基本消失;对照组小鼠肌肉组织中Caspase-3和Caspase-9都呈现低表达。在移植肿瘤7天的肿块实体组织中,Caspase-3和Caspase-9都呈阳性表达;在14天时实体组织中表达降低,但是在周围组织中的表达增强;在21天时周围组织的表达也减弱。说明普通昆明白小鼠幼鼠中不能够建立真正的肿瘤模型,但是短期内仍能形成瘤块,在不同时间点,Caspase-3和Caspase-9表达具有明显的区域和量的差异,但是Caspase-3和Caspase-9表达部位和表达量的变化具有相似性。

苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌PC-9细胞增殖和c-myc表达的影响

目的:研究贝特类药物苯扎贝特和非诺贝特对肺腺癌PC-9细胞增殖和c-myc表达的影响。方法:采用CCK8法检测苯扎贝特和非诺贝特(12.5、25、50、100、20μmol/L)作用48 h对PC-9细胞存活率的影响。另将PC-9细胞分为给药组和对照组,给药组分别加入低、中、高浓度(25、50、100μmol/L)的苯扎贝特和非诺贝特,对照组加入二甲基亚砜,作用48 h后,采用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况;荧光定量聚合酶链法(qRT-PCR)检测细胞中c-myc mRNA相对表达量;Western blot法检测细胞中c-myc蛋白相对表达量。结果:上述浓度苯扎贝特作用下PC-9细胞存活率分别为(80.76±3.2)%、(74.35±5.06)%、(62.8±1.23)%、(59.03±1.55)%、(39.8±1.01)%;而非诺贝特作用下PC-9细胞存活率分别为(74.46±1.30)%、(61.91±4.77)%、(48.95±2.8)%、(37.05±1.55)%、(32.49±1.36)%。与对照组比较,苯扎贝特和非诺贝特的中、高浓度组G1期细胞比率均明显增加,苯扎贝特和非诺贝特的低、中、高浓度组的细胞凋亡率均明显增加,c-myc mRNA和蛋白相对表达量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:苯扎贝特和非诺贝特可抑制PC-9细胞增殖,并下调c-myc表达。

马钱子碱通过阻滞细胞周期抑制人肺癌细胞株PC-9增殖

背景与目的已有的研究表明:Cyclin D1和Cyclin E是细胞周期中重要的正性调控因子,其高表达与肿瘤的增殖密切相关。本研究旨在探讨马钱子碱(Brucine)对人肺癌细胞株PC-9增殖的影响,及其与Cyclin D1和Cyclin E表达的影响。方法将PC-9细胞分为4组:空白对照组、DMSO对照组(2‰)、150μM Brucine组、300μM Brucine组。CellTiter-Glo发光法、平板克隆形成实验观察该药对PC-9细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期,qRT-PCR检测细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E mRNA的表达,Western blot检测细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E蛋白的表达。结果与对照组比较,CellTiter-Glo发光法、平板克隆形成实验结果显示:Brucine可以抑制人肺癌细胞株PC-9的增殖,并呈时间-剂量依赖性(P<0.01);流式结果显示对细胞周期的影响主要是阻滞PC-9细胞于G0/G1期;qRT-PCR结果显示Cyclin D1、Cyclin E mRNA的表达下调;Western blot结果显示Brucine使Cyclin D1、Cyclin E的表达降低。结论 Brucine能明显抑制人肺癌细胞株PC-9的增殖,机制主要与其通过下调Cyclin D1、Cyclin E表达,进而阻滞细胞周期有关。

探讨嵌合内含子对非小细胞肺癌细胞系PC-9上皮间质转化的影响

目的:探讨嵌合内含子(chimeric intron)对人非小细胞肺癌PC-9细胞株上皮间质转化(EMT)的影响和作用。方法:以psiCHECK-2质粒为基本框架,插入嵌合内含子构建出psiCHECK-2-Intron双荧光素酶报告基因重组质粒载体,再将psiCHECK-2-Intron和psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,通过双荧光素酶活性快速检测该重组质粒载体在真核细胞中的表达情况,然后分别应用细胞划痕实验和Matrigel侵袭实验观察PC-9细胞迁移和侵袭能力的变化,再通过qRT-PCR以及Western-Blotting检测EMT相关分子标志物:N-钙黏蛋白(N-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)以及转录因子Snail表达水平的改变。结果:与对照组相比,Intron组PC-9细胞的侵袭能力明显降低(P<0.001),N-cadherin、β-catenin和Snail等相关分子标志物的表达量明显下调(P<0.001)。结论:嵌合内含子能够抑制非小细胞肺癌PC-9细胞株的EMT转化,其作用机制可能与N-cadherin、β-catenin和Snail表达量下调有关。

微小RNA-338-3p调控信号转导和转录激活因子1对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1表达和细胞凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-338-3p(miR-338-3p)对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药肺癌细胞株PC-9/GR中程序性死亡配体1(PD-L1)表达和细胞凋亡的影响及相关机制。方法 体外培养PC-9细胞、PC-9/GR细胞,采用0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00μmol/L吉非替尼处理确定用药浓度;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-338-3p表达。将PC-9/GR细胞分为对照组、miR-338-3p NC组(转染miR-338-3p NC)、miR-338-3p组(转染miR-338-3p模拟物)和信号转导和转录激活因子1(STAT1)抑制剂组(转染miR-338-3p模拟物+100μmol/L氟达拉滨)。4组均添加1.00μmol/L吉非替尼,转染后qRT-PCR检测细胞中miR-338-3p表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白印迹(WB)法STAT1、p-STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 当吉非替尼浓度升高至1.00μmol/L时,PC-9细胞与PC-9/GR细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与PC-9细胞相比,PC-9/GR细胞中miR-338-3p表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。转染后,qRT-PCR结果显示,miR-338-3p组、STAT1抑制剂组的miR-338-3p表达水平均高于miR-338-3p NC组、对照组,差异有统计学意义(P>0.05)。与miR-338-3p NC组相比,miR-338-3p组PC-9/GR细胞增殖率及细胞中PD-L1、Bcl-2蛋白表达水平降低,凋亡率及细胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-338-3p组相比,STAT1抑制剂组PC-9/GR细胞增殖率及细胞中PD-L1、Bcl-2蛋白表达水平升高,凋亡率及细胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-338-3p可抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞株PC-9/GR细胞中PD-L1表达,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与激活STAT1有关。

复方海蛇胶囊抗PC-12细胞凋亡研究

目的：研究复方海蛇胶囊对β-淀粉样蛋白（Aβ1～42）诱导的PC-12细胞凋亡的影响，探讨复方海蛇胶囊应用于痴呆的治疗机制。方法：采用四氮唑蓝比色法（MTr法）确定复方海蛇胶囊对神经生长因子（NGF）诱导培养PC-12细胞的安全剂量后，加或不加Aβ，分别用MTr法、流式细胞术（FCM术）检测不同质量浓度的复方海蛇胶囊（0．01，0．1，1，5mg·mL^-1）对PC-12细胞凋亡的影响；用蛋白免疫印迹（Western-blot）法分别检测凋亡执行酶caspase-9与caspase-3的活性。结果：复方海蛇胶囊对NGF诱导培养的PC-12细胞的安全剂量为小于10mg·mL^-1。复方海蛇胶囊各剂量组对A卢诱导的PC-12细胞的凋亡具有明显的抑制作用。各组数据（A）分别为：1．75±0．12，0．73±O．35，0．79±O．11，0．83±O．07，1．31±O．07和1．80±0．38，与空白组比较P〈0．01，流式细胞检测中凋亡细胞的百分率降低（1．93±0．41）％，（46．17±4．08）％，（35．35±4．63）％，（28．62±3．81）％，（15．13±3．15）％，（7．84±1．76）％，与空白组比较P〈0．01。另外，复方海蛇胶囊抑制了A口诱导PC-12细胞的caspase-9和caspase-3活性的增高。结论：复方海蛇胶囊可显著抑制A口诱导PC-12细胞的凋亡，其机制可能通过抑制凋亡执行酶caspase-9，caspase-3的活性实现。

舌鳞状细胞癌中PCDGF和MMP-9蛋白的表达及临床意义

目的：探讨畸胎瘤细胞源性生长因子（PC cell-derived growth factor,PCDGF）和基质金属蛋白酶-9（Matrix metallopro-teinase-9,MMP-9）在舌鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理参数之间的关系。方法：采用免疫组织化学方法检测45例舌鳞状细胞癌和12例正常舌组织中PCDGF和MMP-9蛋白的表达情况。结果：与正常舌组织相比,PCDGF和MMP-9蛋白在舌鳞状细胞癌中的表达明显升高（P〈0.05）。PCDGF和MMP-9蛋白的表达随舌鳞状细胞癌的浸润深度增加而增加（P〈0.05）,在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组（P〈0.05）,在临床Ⅲ~Ⅳ期的表达高于临床Ⅰ~Ⅱ的表达（P〈0.05）。PCDGF和MMP-9蛋白的表达与患者年龄、性别及组织学分级无相关性（P〉0.05）。PCDGF和MMP-9蛋白在舌鳞状细胞癌中的表达呈正相关r（s=0.543,P〈0.01）。结论：PCDGF和MMP-9蛋白在舌鳞状细胞癌的发展、浸润和转移中可能起重要作用,且二者之间可能存在协同作用。

广藿香酮对肺癌PC-9细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨广藿香酮对肺癌PC-9细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移和凋亡的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:配制不同浓度的广藿香酮(50,100,150,200,250,300,350,400μmol·L^(-1))处理人肺癌PC-9、A549和95D细胞24,48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活力,筛选出其中对广藿香酮最敏感的细胞株并确定低、中、高浓度用于后续实验;将PC-9细胞分为对照组和广藿香酮低、中、高浓度组,采用平板克隆实验、Transwell小室实验、划痕愈合实验和流式细胞术分别检测细胞克隆形成、侵袭、迁移能力和细胞凋亡;采用Western blot检测PC-9细胞中PCNA、Vimentin、MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白的表达。结果:广藿香酮可有效抑制PC-9、A549和95D细胞增殖能力,且呈剂量和时间依赖性,其中PC-9细胞对广藿香酮最敏感;广藿香酮浓度分别为100,150,200μmol·L^(-1)处理PC-9细胞48 h,与对照组比较,广藿香酮低、中、高浓度组中细胞克隆形成、侵袭和迁移能力显著下降,细胞凋亡率显著上升;Western blot结果显示,与对照组比较,广藿香酮低、中、高浓度组PC-9细胞中PCNA、Vimentin、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达显著减少,Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的表达显著增加。结论:广藿香酮能显著抑制肺癌PC-9细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,分子机制可能与下调细胞中PCNA、Vimentin、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达,上调Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的表达有关。

肺癌颅脑转移动物模型建立的比较

目的通过左心室注射、尾静脉注射、胸腔注射3种方法,建立肺癌颅脑转移的动物模型。方法18只BALB/c NUDE裸鼠随机分为三组,分别经左心室注射、尾静脉注射、胸腔注射途径,接种具有颅脑转移潜能的人肺腺癌PC-9细胞(1×10^(6)/0.1 mL),接种后观察裸鼠状态,在裸鼠出现恶病质时处死;解剖裸鼠,肉眼观察肺和颅脑的转移情况,并对其进行HE染色处理。结果左心室注射组:裸鼠注射后18 d开始出现体质量下降,逐步出现恶病质,并于27 d将裸鼠全部处死;解剖观察肺、颅脑无异常;HE染色证实,肿瘤病灶并未在它们的肺部发现;6只裸鼠均有共济失调、偏瘫、跛行的症状,是颅脑转移的病灶引起的。尾静脉注射组:注射后55 d裸鼠体质量开始减轻,92 d开始出现恶病质,处死于112 d;解剖观察肺、颅脑无异常;HE染色证实4只裸鼠身上出现肺部肿瘤灶;6只裸鼠均未发现颅脑转移。胸腔注射组:裸鼠于注射后22 d出现胸壁瘤结;35 d开始有消瘦,恶病质渐起,42 d处死;解剖观察肺部、胸腔见多发肿瘤结节,并胸膜、肋骨、脊柱浸润;HE染色证实6只裸鼠全部表现为肺部转移;6只裸鼠均未发现颅脑转移。结论左心室注射组脑转移率为100%,肺癌颅脑转移动物模型建立的可靠方法是经左心室注射途径。

盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制探讨

目的观察盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌PC-9细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期的PC-9细胞,以40μmol/L盐酸埃克替尼培养0、2、4、8、12、24 h,以0、20、40、60、80μmol/L的盐酸埃克替尼处理12 h,采用MTT法检测细胞增殖活性;将对数生长期的PC-9细胞分为给药组和对照组,分别以40μmol/L盐酸埃克替尼、DMSO处理8 h,用流式细胞仪检测凋亡细胞并计算凋亡率,Western blot法检测JAK2、p-JAK2、信号转导与激活因子3(STAT3)、p-STAT3和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白,细胞免疫荧光技术观察并计算STAT3入核细胞百分率。结果随着盐酸埃克替尼浓度的增加及作用时间的延长,PC-9细胞增殖活性逐渐降低,40、60、80μmol/L与0μmol/L-比较,8、12、24 h与0 h比较,P均<0.05。给药组PC-9细胞凋亡率3.70%±0.39%,明显高于对照组的1.40%±0.21%,P<0.05。与对照组比较,给药组p-JAK2、p-STAT3相对表达量均减少(P均<0.05),VEGF蛋白相对表达量亦减少(P<0.01)。给药组STAT3入核细胞百分率为36.48%±2.12%,低于对照组的86.56%±1.82%(P<0.01)。结论盐酸埃克替尼可抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡;其可能通过抑制JAK2-STAT3信号通路活性及STAT3入核,并下调VEGF蛋白表达发挥作用。

用于活体成像的人肺腺癌自发骨转移小鼠模型

目的建立小鼠人肺腺癌PC-9细胞株骨转移模型,初步探讨由模型动物中分离上皮-间质细胞转化(EMT)癌细胞的可行性。方法采用肺原位注射法对低、中、高浓度组的雄性BALB/c裸鼠分别注射1×104、5×104、1×105个/20μL的高骨亲和性的人肺腺癌PC-9细胞悬液,对照组注射5×104/20μL的原始人肺腺癌PC-9细胞,空白组注射20μL空白混合胶体,观察小鼠的生存时间、体重变化及肺腺癌骨转移模型的成模率,并采用流式细胞技术对分离外周血EMT癌细胞进行鉴定。结果注射PC-9细胞后21 d,对照组和低、中、高浓度组小鼠均出现体重下降、摄食减少等,与空白组相比体重明显降低(P<0.05)。高浓度组小鼠注射PC细胞后20 d出现骨转移病灶,27 d出现死亡。低、中、高浓度组的肺腺癌骨转移模型成模率分别为0%(0/5)、25%(2/8)、60%(6/10)。造模成功的小鼠肺部和骨骼出现转移灶,病理检查可见肺腺癌细胞,其外周血可成功分离EMT癌细胞,其中EMT癌细胞阳性小鼠骨转移发生率较高。结论本研究成功构建了可用于活体成像的人肺腺癌骨转移小鼠模型,并可从其外周血中分离EMT癌细胞,为肿瘤生长转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供了重要工具。

原花青素对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖的影响及机制研究

目的研究原花青素体外对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖的影响及其作用机制。方法体外培养人骨肉瘤Saos-2细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;PI染色法检测细胞凋亡率;ELISA法检测Caspase-9、Caspase-12、Survivin含量;Bradford法检测SOD、M DA含量。结果 PC在48 h和72 h对Saos-2细胞的体外增殖均具有抑制作用,并具有浓度和时间依赖性;40、80、160μg/m L浓度的PC均诱导Saos-2细胞凋亡;促进Caspase-9和Caspase-12蛋白表达,抑制Survivin蛋白表达;增加细胞内SOD的活性,降低M DA的含量。结论 PC可抑制Saos-2细胞的增殖,可能与其增加机体的抗氧化功能及启动死亡受体通路、内质网通路、线粒体通路这三条途径诱导细胞凋亡有关。

盐酸埃克替尼对人肺腺癌细胞系PC-9作用的比较蛋白质组学研究

目的应用比较蛋白质组学方法分析盐酸埃克替尼作用前后人肺腺癌细胞系PC-9细胞相关蛋白的变化,从蛋白质水平探讨埃克替尼的作用机制。方法应用人类EGFR基因突变检测试剂盒和实时定量PCR仪检测PC-9细胞EGFR突变;应用MTT法检测埃克替尼对PC-9细胞增殖的影响;应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分别对未经干预的PC-9细胞总蛋白和经埃克替尼作用的PC-9细胞总蛋白进行分离,获得蛋白质表达谱;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果 PC-9细胞的EGFR基因存在第19外显子缺失突变;在10-4-10-9M浓度范围内,埃克替尼明显抑制PC-9细胞的生长,且呈浓度依赖;埃克替尼诱导前后表达水平≥1.5倍的蛋白点共有56个。选取差异≥1.7倍的29个蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,最终鉴定出16种蛋白质。根据功能,这些蛋白可分为代谢酶类、细胞骨架类、分子伴侣、信号传导分子、转录及翻译相关蛋白。结论应用比较蛋白质组学方法初步鉴定了16种蛋白质,这些蛋白质与埃克替尼作用机制密切相关,部分可能成为新的分子治疗靶点。

隐丹参酮抗肺腺癌作用的研究

目的探讨隐丹参酮(CPT)对人肺腺癌细胞株A549和PC-9诱导凋亡的作用及其可能机制。方法不同浓度的CPT分别作用A549和PC-9细胞24和48h,CCK-8法检测细胞存活率,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路相关蛋白磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达水平。结果 CPT能够抑制A549和PC-9细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性。CPT作用于A549和PC-9细胞24h后,细胞凋亡率随CPT浓度增加呈增长趋势,而线粒体膜电位降低。CPT作用于A549和PC-9细胞后cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表达水平增加,p-STAT3蛋白表达水平下降。结论 CPT对人肺腺癌细胞A549和PC-9有显著的增殖抑制作用和诱导凋亡效应,线粒体凋亡途径和STAT3信号通路可能参与了这一过程。