PCI-32765和Bortezomib对B细胞肿瘤细胞系细胞增殖、凋亡的影响及其机制的研究

本研究旨在探讨Btk抑制剂PCI-32765和蛋白酶体抑制剂bortezomib对Raji、Ramos细胞的增殖、凋亡的影响及其作用机制。PCI-32765和bortezomib单药及联合用药处理Raji和Ramos细胞后,分别运用CCK-8法及流式细胞术检测细胞的增殖与凋亡,Western blot法检测Btk、NFκB、c-IAP1、Bcl-xL、caspase-3等蛋白的表达。结果表明:①PCI-32765(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μmol/L)和bortezomib(10、20、30、40、50、60、80 nmol/L)处理Raji和Ramos细胞48 h,均可抑制细胞增殖,抑制率呈剂量依赖性,且两药具有协同作用;②PCI-32765(2.0μmol/L)、bortezomib(20 nmol/L)单药及联合用药处理Raji和Ramos细胞不同时间(8、12、24、36、48、72 h),均可抑制细胞存活率,抑制率呈时间依赖性,且两药具有协同作用;③PCI-32765(2μmol/L)和bortezomib(20 nmol/L)单药及联合用药处理Raji和Ramos细胞48 h,可明显促进Raji及Ramos细胞的凋亡。Raji细胞实验结果,空白对照组、PCI-32765和bortezomib单药组、联合用药组的细胞凋亡率分别为10.34±0.53%、24.26±0.91%、43.66±1.08%与74.06±0.72%,各组间有统计学差异(P<0.05);Ramos细胞实验结果,空白对照组、PCI-32765和bortezomib单药组、联合用药组的细胞凋亡率分别为15.16±1.49%、71.36±0.82%、75.32±2.36%与84.30±0.91%,各组间有统计学差异(P<0.05);④PCI-32765和bortezomib单药处理Raji、Ramos细胞后,细胞内Btk、NFκB、Bcl-xl及cIAP1的表达水平较对照组降低,Caspase-3的表达水平升高,两药联用后,作用增强。结论:PCI-32765和bortezomib可以协同抑制Raji与Ramos细胞的增殖,促进其凋亡,其机制可能与抑制Btk、NFκB的活性,下调Bcl-xl及c-IAP1等抗凋亡蛋白,同时上调Caspase-3等凋亡蛋白的表达而发挥作用。

依鲁替尼与达沙替尼对急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制及其机制实验研究

目的:研究Btk抑制剂PCI-32765(依鲁替尼)和酪氨酸激酶Bcr-abl抑制剂Dasatinib(达沙替尼)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞(Sup-B15、RS4;11)增殖、凋亡的影响,为其用于Ph+和Ph-ALL靶向治疗提供实验依据。方法:PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药处理Sup-B15与RS4;11细胞后,用CCK-8法检测细胞的凋亡,刘氏染色法观察对细胞形态变化,Western blot法检测PCI-32765和Dasatinib对Btk上下游信号分子表达及活性的影响。结果:PCI-32765对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,Sup-B15细胞对其敏感性高于RS4;11,IC_(50)值分别为3和8μmol/L(P<0.05)。Dasatinib对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用也呈剂量依赖性,IC50值分别为5μmol/L和5 nmol/L,相差1 000倍(P<0.01)。Dasatinib与PCI-32765联用后,增殖抑制作用明显增强(P<0.05)。PCI-32765和Dasatinib分别作用RS4;11和Sup-B15细胞8、12、24、36、48和72 h,PCI-32765与Dasatinib单药组及联合用药组的细胞存活率均逐渐降低,且两药具有协同作用,呈时间依赖性。PCI-32765或/和Dasatinib处理的RS4;11和Sup-B15细胞体积缩小,细胞质密度增加,核固缩、核偏位、核碎裂,但小剂量Dasatinib单药对RS4;11细胞凋亡促进不明显,联合用药组凋亡细胞增多。PCI-32765或/和Dasatinib处理SupB15细胞BCR-ABL、Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关;RS4;11细胞Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关。结论:PCI-32765或Dasatinib均可明显抑制Sup-B15和RS4;11细胞增殖,诱导其凋亡,且有协同作用。其作用机制可能与通过活化B细胞受体(B cell receptor,BCR)信号通路、促进细胞凋亡有关。

Btk抑制剂依鲁替尼对高糖刺激巨噬细胞炎症的抑制作用及机制

目的探讨Bruton酪氨酸激酶(Btk)抑制剂依鲁替尼(PCI-32765)对高糖诱导巨噬细胞炎症的抑制作用及机制。方法以骨髓来源巨噬细胞(BMMs)为研究对象,优化实验条件后,分为低糖组(LG)、抑制剂对照组(LG+PCI-32765)、高糖组(HG)和抑制剂组(HG+PCI-32765)。采用流式细胞术鉴定巨噬细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞及细胞上清中炎症因子——单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的含量及mRNA相对表达量;蛋白印记法(Western blot)检测iNOS、Btk、ERK、JNK、p38MAPK、NF-κB p65、 IκB及其磷酸化蛋白水平;激光共聚焦法检测巨噬细胞的活化及p65核转移。结果与低糖组比较,高糖组炎症因子的表达升高(P<0.05),抑制剂组较高糖组有下降(P<0.05);高糖组p-Btk相对表达量较低糖组升高(P<0.01),p-ERK、 p-JNK、 p-p38MAPK、 NF-κB p-p65和p-IκB的相对表达量亦升高(P<0.05),而PCI-32765可降低其中p-Btk、 p-ERK、 NF-κB p-p65和p-IκB的表达(P<0.05);巨噬细胞在高糖刺激下发生激活,iNOS表达升高(P<0.01),PCI-32765可减低其表达(P<0.05);高糖刺激下p65发生核转移,PCI-32765使其减少。结论 PCI-32765可以抑制高糖引起巨噬细胞激活,通过下调ERK和NF-κB信号通路抑制炎症因子的释放。