基于多重PCR-LDR技术建立近交系大鼠单核苷酸多态性遗传检测方案

目的建立一套基于多重PCR-连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)技术的近交系大鼠单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)检测方案。方法在5个品系的SPF级近交系大鼠1~20号常染色体和X染色体上共选取40个大鼠SNP位点,将SNP位点随机分为4组,构建基于多重PCR-LDR技术的近交系大鼠4组SNP位点基因检测方案。采用本方案检测国内另两家大鼠供应商的9个常用大鼠品系。最后,通过第三方实验室对不同DNA聚合酶的扩增效果进行比对,验证本方案的可行性。结果用所构建的近交系大鼠SNP遗传检测方案测试5个大鼠品系时,各样本的所有位点均得到了良好的扩增结果。采用本方案检测国内另两家大鼠供应商的9个常用大鼠品系时也得到了良好的扩增结果,40个SNP位点在每个近交系大鼠中均为纯合。用3种来源不同的DNA聚合酶同时检测相同大鼠DNA样本的结果显示,Multiplex PCR Kit、AmpliTaq Gold^(TM)360 DNA聚合酶、PlatinumⅡTaq热启动DNA聚合酶在第1~3组SNP位点均有扩增产物的电泳峰,其中PlatinumⅡTaq热启动DNA聚合酶在第4组SNP位点中少了一个扩增产物的电泳峰。另外,不同实验室间的比对结果显示,相同扩增体系的检测结果一致。结论基于多重PCR-LDR技术成功建立了一套覆盖所有常染色体与X染色体的大鼠SNP检测方案,该方法的稳定性和重复性俱佳。

用于“野生小家鼠来源一号染色体替换系”构建的PCR-LDR分型系统

目的建立用于"野生小家鼠来源一号染色体替换系"构建的PCR-LDR(polymerase chain reactionand ligase detection reaction,PCR-LDR)分型系统。方法采用易于判断的二元性遗传标记单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphism point,SNP),应用连接酶检测技术(ligase detection reaction,LDR),建立PCR-LDR分型方案。结果三组多重PCR-LDR分型方案适用于覆盖整条一号染色体的29个SNP遗传位标的分型,位点间平均遗传距离在6.25厘摩(centimorgan,cM)。结论实现了后代小鼠快速、高通量的基因分型,可准确检测1号染色体各区段的重组事件。

应用PCR-LDR法检测乙型肝炎病毒核苷类药物耐药多基因突变位点

目的用多重聚合酶连接反应-连接酶检测反应分型法(PCR-LDR)同时检测乙型肝炎病毒(HBV)的180、181、184、204、236、250位点突变。方法以50例慢性乙型肝炎患者血清中HBV的DNA为模板,获得PCR-LDR反应探针连接产物,用ABI 3130Sequencer进行检测分析。结果共检测出拉米夫定耐药突变8例(16%)、阿德福韦耐药突变5例(10%),恩替卡韦耐药突变1例(2%),拉米夫定和阿德福韦同时耐药突变1例(2%),突变情况与直接测序法检测的结果完全一致。结论用PCR-LDR法可以快速检测HBV基因的已知位点突变,与直接测序等其他方法相比具有更简单、方便、快捷的优势,有利于临床医生早期发现乙肝病人的耐药情况并及时更改治疗方案。

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。

应用PCR-LDR法比较2个地区慢性乙型肝炎病毒核苷类药物耐药突变和基因型

目的探讨上海和兰州2个地区的慢性乙型肝炎病毒核苷类药物耐药突变和基因型的比较及关系。方法取上海和兰州地区慢性乙型肝炎患者194例和325例的血清,利用聚合酶链反应(PCR)-连接酶反应检测技术(LDR)法对常见的7种耐药突变位点和B型、C型两种型别进行检测。使用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。结果 (1)2个地区均以C型为主,上海、兰州分别为79.3%、81.4%。(2)上海地区突变比率(48.9%)高于兰州地区(35.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。2个地区耐药突变均以拉米夫定突变为主,占75.7%(153/202,上海68/92,兰州85/110),2个地区导致拉米夫定耐药突变位点上差异有统计学意义(P<0.05);而2个地区的阿德福韦耐药位点均以rtA181T/V为主,地区间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)是否耐药突变与基因型无相关性,C基因中上海地区的突变比率(49.0%)高于兰州地区(35.4%),差异有统计学意义(P<0.05)。(4)4种耐药比率在与基因型无相关性。结论上海、兰州2个地区在基因型分布上相似,上海地区发生耐药比率更高,2个地区均显示发生耐药与否以及耐药类型与基因无关。

同时检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒和伪狂犬病毒连接酶检测反应-PCR基因芯片检测方法的建立

为快速、灵敏、准确地同时检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和伪狂犬病毒(PRV)的方法,本研究采用连接酶检测反应(LDR)-PCR和基因芯片技术建立一种新型检测方法。首先在3种病毒的保守区内分别设计一对LDR探针,两端各连接一段通用序列,依次进行LDR、通用引物荧光标记扩增和芯片杂交,同时比较引物标记和Cy5-dCTP标记方法的灵敏度。结果表明该方法可以特异地检测PCV2、PPV和PRV3种病毒,而对牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪圆环病毒1型检测结果均为阴性;对3种病毒的最低检测限少于10个拷贝;Cy5-dCTP标记检测的灵敏度显著高于引物标记。利用建立的方法对41例临床样品进行检测,与普通PCR检测结果符合率为97.6%～100%。该方法的建立为基础研究和临床应用提供了技术平台。

基于PCR/LDR技术的水稻香味等位基因Badh2-E2功能性分子标记

水稻中水稻甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)功能缺失导致其酶促反应的底物2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的累积,使得稻米产生香味。水稻香味等位基因badh2-E2在中国的香稻育种中有较广泛的应用。本研究根据badh2-E2香味等位基因在第二外显子处7 bp缺失,设计了一个基于PCR/LDR技术的功能性分子标记。利用PCR/LDR标记对‘申繁24’、‘申恢26’,及其杂交F1代的基因型进行鉴定,可以准确地鉴定出badh2-E2位点的基因型。用PCR/LDR标记对杂交F2代群体的基因型进行鉴定,发现badh2-E2阳性纯合型、杂合型和badh2-E2阴性纯合型这3种基因型符合1∶2∶1分离比。本研究结果为标记辅助育种提供了一种新的标记类型,具有一定的应用价值。

山羊GDF9基因多态性与产羔数关联分析研究

采用PCR-SSCP技术检测山羊GDF9基因外显子突变位点,发现编码序列第183 bp、719 bp、959 bp、1189bp处分别发生了C→A、C→T、A→C、G→A的单碱基突变。序列分析显示C183A突变没有引起氨基酸的改变,C719T突变使蛋白质第240位氨基酸残基由缬氨酸变为丙氨酸,A959C突变使第320位氨基酸残基由谷氨酰胺变为脯氨酸,G1189A突变导致第397位氨基酸残基由缬氨酸变为异亮氨酸。应用LDR技术对济宁青山羊(234只)、鲁北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)进行GDF9四个突变位点的群体检测,利用SAS软件GLM过程对四个位点的基因型效应和产羔数进行了最小二乘分析,结果表明C183A突变对济宁青山羊和鲁北白山羊产羔数没有显著影响,但对沂蒙黑山羊的产羔数有显著影响(P<0.05),CC型产羔数比AC型多0.11只(P<0.05);C719T突变和A959C突变对济宁青山羊、鲁北白山羊、沂蒙黑山羊的产羔数均没有显著影响(P>0.05);G1189A突变对山羊产羔数没有显著影响(P>0.05),对鲁北白山羊产羔数有显著影响(P<0.05),AG型产羔数比AA型多0.42只(P<0.01),G1189A突变对沂蒙黑山羊产羔数有极显著影响(P<0.01),AA型产羔数分别比AG型、GG型多0.34只(P<0.05)、0.38只(P<0.05)。

小鼠冷冻胚胎和精子SNP遗传鉴定方法的建立

目的建立小鼠冷冻胚胎和精子SNP(single nucleotide polymorphism)分型方法,用于冷冻胚胎和精子快速遗传鉴定方案。方法以中科院上海实验动物中心(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心)提供的小鼠冷冻胚胎和精子为样本,采用全基因组扩增技术和PCR-LDR分型技术建立小鼠冷冻物SNP遗传鉴定方法。结果全基因组扩增技术能大幅度增加冷冻胚胎样本的DNA总量;PCR-LDR分型方法适用于小鼠全基因组45个SNPs的分型;分型确定C57BL/6,BALB/c,FVB/NJ等胚胎和精子各10种近交系,SNP位点信息与测序结果一致;小鼠冷冻胚胎个数与SNPs检出个数成正比,当胚胎数达到12以上时SNP检出率100%。结论实现近交系小鼠冷冻胚胎和精子快速SNP基因分型及遗传质量鉴定。

伊立替康毒副作用预测基因UGT1A1多态性三种检测方法的比较研究

目的：比较利用荧光定量 PCR 、PCR‐LDR 和直接测序三种方法对45例肿瘤患者外周血 UGT1A1＊28、UGT1A1＊6、UGT1A1＊93、UGT1A1＊60四个位点的基因分型结果。方法利用荧光定量 PCR 、PCR‐LDR及直接测序三种方法同时检测 UGT1A1基因四个位点的多态性。结果三种检测方法对45例肿瘤患者的基因分型结果完全一致。结论三种检测方法各有优缺点，可根据具体实验需要进行选择；其中荧光定量 PCR 方法检测灵敏度高，用时短，操作简单，避免污染，较适用于临床检测。

检测鹿黏膜病病毒LDR-PCR方法的建立

为准确特异灵敏地检测鹿黏膜病病毒,本研究建立了一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计1对LDR探针,LDR探针两端各连有1段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,本方法可以特异地检测BVDV,最低检测限为101个拷贝。此方法的建立为BVDV基础研究和临床应用提供了良好的技术平台,为进一步开发高通量的多病原检测技术提供了技术基础。

多重PCR-LDR法检测人体药物代谢酶基因位点多态性

目的构建一套基于多重聚合酶连接反应-连接酶检测反应(polymerasechainreaction-ligasedetectionreaction,PCR-LDR)体系的分型法,用于同时检测多种人体主要药物代谢酶基因位点的突变。方法选择药物代谢酶相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,设计合成各SNP位点的PCR引物和LDR探针,以人口腔黏膜细胞中提取的DNA为模板,获得PCR-LDR反应连接产物,采用ABI 3130XL进行检测分析。结果采用本研究建立的PCR-LDR分型方法,对不同个体的14个SNP位点进行分型,分型结果与测序结果完全一致。结论本研究建立的PCR-LDR分型方法能够同时对14个SNP位点进行一次性分型,结果准确、可靠,是一种简便有效且低成本的SNP分型方法。

单核苷酸多态性（SNP）在近交系小鼠遗传检测中的应用

目的 利用单核苷酸多态性（SNP）位点构建多重聚合酶链反应和链接酶反应（PCR-LDR）方案,为近交系小鼠的遗传检测提供一种快速、简便的方法.方法 在SNP公共数据库中挑选51个SNP位点,该51个位点分布于每条常染色体和性染色体,共分为5组,进行多重PCR-LDR方案构建,并将该方案作为遗传质量检测方法对采集的7个近交系样本进行检测.结果 在送检的7个近交系小鼠样本中,纯合度都为100％,相同来源相同品系小鼠的遗传背景一致,但在不同单位的近交系小鼠中,某些SNP位点有差异,CBA/Ca/BK1和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位点的遗传检测结果不同,C57BL/6/BK1和C57BL/6JS1ac在c7、c10位点的遗传检测结果不同.另外,两家公司各有5个位点在所有品系中基因型相同,因此有效位点数各为46个.结论 构建的多重PCR-LDR方案能有效对两家动物生产单位的近交系小鼠进行检测,可用于常见近交系小鼠快速、高通量的基因分型,有利于大规模遗传质量检测和品系鉴定.

老年患者中血管紧张素原基因多态性与缺血性脑血管疾病的相关性研究

目的 探讨血管紧张素原（AGT）基因多态性与老年患者缺血性脑血管疾病（ICVD）之间的关系。方法 采用基于高温连接酶反应（LDR）的PCR-LDR基因多态性检测方法对50例老年ICVD患者和50例老年健康志愿者进行了AGT基因常见的5个多态性位点检测,分析其相关性、结果 病例组AGT基因SNP位点rs699CC、rs4762CC和rs3789678CC的基因型频率（分别为0.80、0.92和1.00）与对照组的基因型频率（分别为0.58、0.60和0.68）比较,组间差异具有统计学意义（分别为χ~2=6.41,P=0.041;χ~2=15.41,P〈0.001;χ~2=19.048,P〈0.001）;病例组AGT基因SNP位点rs699C、rs4762C和rs3789678C的等位基因频率（分别为0.86、0.94和1.00）和对照组的等位基因频率（分别为0.74、0.77和0.84）比较同样差异具有显著性（分别为χ~2=4.50,P=0.034;χ~2=11.66,P=0.001;χ~2=17.39,P〈0.001）、对其进行风险分析,未见携带其中任一基因型的人发生ICVD的危险性明显增加、结论 AGT基因SNP位点rs699CC、rs4762CC和rs3789678CC基因型可能是老年患者ICVD的独立危险因素。

Identification of Susceptibility Genes Loci Associated with Type 2 Diabetes

In this study, we selected 10 susceptible SNPs loci to investigate their contribution to susceptibility to type 2 diabetes in Hart Chinese among Hubei population. We genotyped SNPs rs5219, rs1801282, rs1470579, rs1111875, rs1081661, rs7754840, rs4506565, rs13266634, rs4402960, and rs5643981 by using the method of polymerase chain reaction-ligase detection reaction （PCR-LDR）. In a case-control study, we have genotyped the 10 candidate susceptibility SNP loci, and here, we reported that the SNP rs5219 in KCNJII was strongly associated with type 2 diabetes in Han Chinese in Hubei China There were significant differences in the TT genotype frequency （OR=1.6, 95%CI 1.1-2.3, p=0.01） and T allele frequency （OR=l.3, 95%C1 1.1-1.6, p-0.03） of SNP rs5219 between cases and controls. The other nine SNP loci did not show significant association with type 2 diabetes in Han Chinese in Hubei. The result suggests that KCNJ11 gene is a susceptibility gene of type 2 diabetes among this population.