运用PCR方法鉴别四种犬科动物的研究

建立了狐狸、貉子、水貂和家犬四种犬科动物的PCR鉴别方法。分别用狐狸、貉子、水貂和家犬的特异性引物对,以提取的狐狸、貉子、水貂、家犬的总DNA为模板进行PCR扩增,分别获得701、840、382、473bp的DNA片段,通过限制性内切酶,验证了该PCR扩增的特异性。结果表明,该方法可以有效鉴别出狐狸、貉子、水貂和家犬四种犬科动物。

菌落PCR快速分析抗体库重组率时的假阳性现象

目的 评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性。方法 鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后 ,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点 ,电转化XL1 blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库。比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性。同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR ,以排除相关组分的干扰。结果 建立的Lc库的库容为 1.175×10 6CFU ,Fab库的库容为 1.0 2×10 6CFU。 3种方法鉴定的阳性重组率不同 (Lc的重组率依次为 10 0 %、78%、78% ,Fd的重组率依次为 90 %、6 6 %、6 6 % ,Lc与Fd同时插入的重组率依次为 90 %、5 0 %、5 0 % )。菌落PCR法鉴定的重组率偏高 ,存在假阳性现象。对照PCR提示 ,XL1 blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因。结论 用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率 。

禽传染性支气管炎病毒免疫原基因的PCR获取及其酶切鉴定

介绍用ＲＴ－ＰＣＲ（反转录－聚合酶链反应）获取禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｍ４１株和广东地方致弱株Ｄ４１免疫原（Ｓ１）基因的详细方法，所用引物为ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列，跨幅为１．７ｋｂ。结果表明，两株病毒所获的ＰＣＲ产物与预期的一致；用此对引物，以ＩＢＶＤ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物为模板，扩增出一样的ＤＮＡ片段。试验还显示，国内外几家公司有关ＲＴ和ＰＣＲ的分子生物学试剂可以兼用，适用于国内的有关研究；ＰＣＲ仪则以进口的或水浴锅式的为佳。对ＩＢＶＭ４１株Ｓ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢ酶切图谱分析。

应用PCR-酶切法进行脊肌萎缩症基因诊断

目的 探讨脊肌萎缩症 (SMA)的基因诊断方法。方法 基于运动神经元生存基因 (SMN)的两个同源拷贝碱基上的差异 ,应用PCR -酶切分析法对 10例临床和病理诊断为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型SMA的患者及其直系亲属 16人、2 5例正常对照进行SMN基因检测。结果 10例SMA患者中 9例患者缺失SMN第 7、8号外显子 ,1例患者仅缺失第 7号外显子 ;正常对照组及患者亲属均未发现外显子缺失。结论 PCR -酶切检测SMN基因第 7号、8号外显子缺失是诊断儿童型脊肌萎缩症可靠的基因诊断方法。

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。

RT-nestedPCR和限制性酶切分析用于HV的检测和基因分型

为建立检测肾综合征出血热 (HFRS)患者血清中汉坦病毒 (HV)基因的RT nestedPCR方法 ,并进一步进行限制性酶切分型 ,设计并合成互补于HVS基因片段的引物 ,对 78例HFRS患者血清进行RT nestedPCR检测 ,并对PCR产物进行酶切分析。结果显示 ,阳性率分别为 76 % (≤ 7天 )、6 7% (8～ 14天 )、43% (15～2 1天 )和 2 9% (>2 1天 )。 48例检测阳性患者PCR产物酶切分型 ,47例为Ⅰ型 ,1例为Ⅱ型。提示RT nestedPCR用于早期HFRS患者的HV基因检测 ,具有直接、敏感、特异等优点 。

海水养殖沉积环境微生物总DNA的提取方法研究

传统的微生物分离与培养技术：无法揭示微生物群落的动态变化．为了阐释虾池沉积环境微生态格局的原始组成情况，本研究先以TENP缓冲液去除沉积物中的腐殖酸。继之以溶菌酶-SDS温和裂解，其总DNA的提取效率达90％以上．所获DNA产量达2～20μg／g沉积物（湿），片段大小均在23kb左右，不经纯化即可直接进行PCR扩增和限制性酶切．以该DNA为模板进行PCR—DGGE分析，揭示了虾池沉积物丰富的微生物多样性，该方法是一种适用于虾池沉积物总DNA提取的简便、可靠方法．

18例腓骨肌萎缩症患者的遗传学研究

目的探讨腓骨肌萎缩症(CMT)的遗传学改变特点。方法联合应用PCR-双酶切分析检测CMT病人17p11.2-12上的基因重复,同时结合DNA直接测序方法进行Cx32基因突变分析。共检测18例CMT病人和10例正常健康对照者。结果18例病人中11例检测出1760bp片段,占61,1%。正常对照组未检测到此片段。Cx32基因突变检测发现18例中4例有异常电泳带(22.2%),均为基因重复检测阴性者。其中3例来自同一家系,为X-连锁遗传,另1例为散发家系。DNA序列测定结果:在2个家系的先证者中发现2种新突变。联合两种方法检出率为83.3%(15/18)。结论PCR-双酶切是快速、准确的临床诊断方法,联合Cx32基因突变分析可提高检出率。

福建省B19微小病毒感染的病原学证据

应用套式PCR方法，对44份与B19微小病毒感染症相关的病人血清标本进行检测，其中5份血清标本和扩增产物合有B19病毒的104bpDNA生段，根据B19病毒基因组DNA核苷酸序列分析资料，使用HaeⅢ限制性内切酶切PCR扩增产物，结果产生81和23bp两段DNA，与序列分析结果一致，证实5例患者为B19病毒感染者，从病原学上支持了不久前我们使用血清学方法发现福建省B19病毒感染的报道。

一种克隆载体重组质粒pMD18-T Simple-PCV2的构建

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)的全基因组变异特性,试验设计了1对特异性引物,并从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2(命名为P-S-PCV2),经酶切鉴定、PCR鉴定和序列测定分析的阳性重组质粒被证明含有长为1 767 bp的PCV2片段,同时通过Blast与GenBank中国内外的部分PCV2毒株进行同源性比较分析。结果表明:与国内外12个毒株间的同源性介于95.0%～100%之间,与国内的河北株(HB株)亲缘关系最近,同源性高达100%;与澳大利亚株(AUT2株)亲缘关系最远,同源性为95.0%。说明来源不同国家和地区的猪圆环病毒2型毒株存在地域性差异。

3种常用单核苷酸多态性检测方法的应用比较

目的:通过比较变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、单链构像多态性(single-strandedconformational polymorphism,SSCP)、限制性酶切检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的优缺点,为不同条件下选择最适合的SNP检测方法提供借鉴。方法:DGGE、限制性酶切检测150例大肠癌APEX基因第3外显子,SS-CP检测第5外显子,最后结果经直接测序验证。结果:DGGE检测出17例异常泳动条带;测序结果证实该17例均存在1247A→G的SNP;SSCP检测到57例异常条带;经直接测序证实38例有2197T→G的SNP;PCR-限制性酶切结果与DGGE所测结果完全吻合。结论:DGGE检测结果无假阳性,重复性好,准确率高,而且可判断基因型;SSCP简便易行,但存在假阳性与假阴性,而且不能判断基因型;限制性酶切对SNP位点检测及基因分型均能进行较准确的判断。

非综合征型感音神经性聋患儿GJB2基因突变分析

目的:对非综合征型感音神经性聋患儿的耳聋基因突变进行具体分析,研究GJB2基因突变与相应的特异性临床表现,为耳聋患者的遗传咨询、产前诊断以及临床治疗提供理论基础。方法:收集深圳地区遗传性非综合征耳聋患者100例和健康对照组50例,应用聚合酶链反应和直接测序法,检测GJB2基因的突变情况。结果:通过基因对照,发现100例耳聋患者中共检出携带GJB2 235del C点突变56例,占56%。其中,26例为纯合性突变,30例为杂合性突变。结论:GJB2基因突变是非综合征型感音神经性聋人群重要的分子病因之一,GJB2基因最为常见的突变类型是235del C,对GJB2基因进行临床检测具有重大意义。

牛巴贝斯虫lytB基因的克隆与序列分析

为了对牛巴贝斯虫lytB基因进行克隆与序列分析,试验以兰州株牛巴贝斯虫lyt B基因组为模板进行PCR扩增,将扩增得到的特异性产物克隆到p GEM-T Easy载体上,并对其进行PCR检测、酶切鉴定及序列测定分析。结果表明:试验克隆得到的864 bp基因片段与Gen Bank收录的牛巴贝斯虫lyt B核苷酸序列同源性为97.8%。说明试验成功克隆出牛巴贝斯虫lyt B基因,与Gen Bank收录的牛巴贝斯虫lyt B核苷酸序列具有高度的同源性。

河南地区两个腓骨肌萎缩症家系PMP22基因突变研究

目的分析在河南地区两个腓骨肌萎缩症(CMT)家系的临床表现及PMP22基因重复突变的特点。方法收集两家系中21名成员的临床资料,并应用等位基因特异性PCR-双酶切方法检测17p11.2-1 PMP22基因重复(即1760 bp片段)序列的情况,同时选择50名健康人做为对照。结果两家系中共14名成员经等位基因特异性PCR-双酶切方法检测出PMP22基因大片重复(即1760 bp片段)序列;家系一患病者有3名(Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ11),无临床症状但基因检测结果示PMP22基因重复突变为携带者有6名(Ⅱ9、Ⅲ6、Ⅲ8、Ⅲ10、Ⅳ1、Ⅳ2);家系二患病者有4名(Ⅱ3、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ7),携带者只有Ⅲ5。两家系中余7人及健康对照50人均未检测出上述重复突变。结论 PCR-双酶切法检测PMP22特异性基因重复序列在早期诊断CMT有重要价值。

大豆疫霉卵孢子微量、快速检测方法的建立

采用套筛富集人工接种于土壤中的大豆疫霉卵孢子。结果表明,当接种量为104、103、102、101、100时,富集百分率分别为45.9%、39.6%、11.8%、1.7%、5.6%。采用玻片压碎法提取微量卵孢子中DNA后,采用PCR技术快速进行检测的结果表明,提取10,5,1个卵孢子中DNA进行PCR扩增成功率分别为83.3%、33.3%、0。提取10个卵孢子中DNA进行PCR扩增时,2个处理出现非特异性PCR产物。内切酶MspI能将特异性PCR产物消化为204bp和124bp两个片段;内切酶RsaI能将特异性PCR产物消化为242bp和86bp两个片段。

拟南芥中与植物生长和耐寒相关的miRNA表达载体的构建

本研究通过PCR方法从拟南芥基因组序列中分离了3个理论推断与耐寒相关的miRNA片段(miRNA402,miRNA319和miRNA393)和1个与植物生长相关的片段miRNA172。利用重叠延伸PCR技术将miRNA172小分子,以及3个与耐寒相关的miRNA402,miRNA319和miRNA393小分子串连在一起分别导入植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA,取代表达载体中的GUS基因,构建了pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir31+402+393-pA融合表达载体。经PCR和双酶切及测序鉴定,pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir319+402+393-pA构建成功,为后续利用基因工程手段,miRNA转化木薯,提高木薯生长和木薯耐寒相关研究奠定基础。

快速点突变的优化方法

DNA传统的快速点突变方法即"一步突变法"虽然可使DNA产生突变,但效率不高.市场上出售的快速点突变试剂盒,其突变效率可达80%以上,然而价钱昂贵.本文论述的快速点突变方法,在传统的"一步突变法"基础上做了改进,通过对引物突变点5′端序列Tm值的确定,使引物设计变得简单,初学者可轻松完成DNA的定点突变,而且大大降低了成本,适用于对大量DNA进行定点突变试验.试验结果表明:这种经过改良的方法突变率为96.22%,可为研究人员的试验带来便利,是一种值得推广的新方法.

脊髓性肌萎缩症的基因诊断

目的 探讨脊髓性肌萎缩症基因诊断方法。方法 应用PCR -酶切分析法对 2例SMA患儿进行运动神经元生存基因 (SMN)的基因诊断分析。结果 2例患儿SMN基因第 7,8外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切后 ,仅剩下 16 5bp与12 5bp片断 ,显示为SMN基因 7号、8号外显子缺失。结论 PCR -酶切检测SMN基因 7号、8号外显子缺失可作为脊肌萎缩症的可靠基因诊断方法。