基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响

目的:基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响。方法:从36只SD大鼠中随机选取6只作为对照组,其余大鼠给予高脂饲料联合1%链脲佐菌素(30 mg·kg^(-1))建立糖尿病模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄连解毒汤高剂量组(6.25 g·kg^(-1))、黄连解毒汤中剂量组(3.13 g·kg^(-1))、黄连解毒汤低剂量组(1.56 g·kg^(-1))及二甲双胍组(100 mg·kg^(-1)),每组各6只。各药物组按照相应剂量灌胃给药,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续21 d。第7天、第14天及第21天灌胃后,收集大鼠粪便,提取肠道菌群DNA。利用ERIC-PCR技术和Sanger测序检测大鼠肠道菌群结构与DNA同源性。结果:灌胃第7天,对照组条带较多集中在100~750 bp;与对照组比较,模型组条带在1 000~2 000 bp的亮度增强,在300~750 bp的亮度减弱;与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在750 bp的亮度增强。灌胃第14天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在1 000 bp以上的亮度减弱。灌胃第21天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在300~750 bp的亮度增强。DNA测序结果显示,灌胃第21天,对照组500 bp条带的优势菌群为拟杆菌属、杜氏邓氏菌和金黄杆菌属;模型组400 bp和1 000 bp条带的优势菌群为梭菌目细菌、普拉梭菌、铜绿假单胞菌和杆菌属。灌胃第7天,黄连解毒汤高剂量组750 bp条带的优势菌群为布劳特菌和拟杆菌属;黄连解毒汤中剂量组200 bp条带的优势菌群为脆弱拟杆菌和拟杆菌属;黄连解毒汤低剂量组1 200 bp条带的优势菌群为双发酵副梭菌;二甲双胍组1 000 bp条带的优势菌群为大肠埃希杆菌。灌胃第14天,黄连解毒汤高剂量组700 bp条带的优势菌群为拟杆菌目细菌和假单胞菌;黄连解毒汤中剂量组550 bp条带的优势菌群为假锁杆菌属和链霉菌属;黄连解毒汤低剂量组350 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、杜氏邓氏菌和杆菌科细菌;二甲双胍组290 bp条带的优势菌群为弗格森埃希菌和大肠埃希杆菌。灌胃第21天,黄连解毒汤高剂量组1 000 bp条带的优势菌群为普雷沃氏菌属;黄连解毒汤中剂量组600 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、杜氏邓氏菌和拟杆菌属;二甲双胍组400 bp条带的优势菌属为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、普雷沃氏菌属、杆菌科细菌和杆菌属。结论:黄连解毒汤对T2DM大鼠的肠道菌群结构具有调节作用,菌群调节效果受药物剂量和治疗时间的影响。

基于细胞焦亡PCR芯片分析负重跑训练对增龄大鼠骨骼肌丢失的影响

目的 采用PCR芯片研究细胞焦亡在32周负重跑训练对增龄大鼠趾长伸肌(EDL)丢失进程中的作用。方法 90只SD大鼠分为3组:对照组(C0组,n=10)、增龄不运动组(C组,n=40)和增龄负重跑组(R组,n=40)(着负重袋的跑台训练),C组和R组分别干预8、16、24和32周后取材,即分为C8组、C16组、C24组、C32组、R8组、R16组、R24组和R32组(n=10)。干预后测量大鼠体重和肌肉总量;取EDL称量湿重,HE染色观察肌纤维形态,测试横截面积(FCSA);Western Blot测试细胞焦亡关键蛋白NF-κB、ASC、GSDMD和Caspase1的表达;PCR芯片筛选EDL中的细胞焦亡差异表达基因,qPCR验证芯片结果准确性。结果 (1)C组大鼠体重持续增加,R组大鼠体重相对平稳;C32组肌肉总量及其百分比显著低于C0组;R8组、R24组和R32组肌肉总量百分比显著高于其相应的C组(P<0.05)。(2)R24组和R32组EDL湿重和FCSA分别显著高于C24组和C32组;C组各组FCSA均低于C0组(P<0.05)。(3)C16组和C24组NF-κB、GSDMD,R16组ASC,C8组、C16组、C24组和R8组Caspase1蛋白含量显著高于C0组(P<0.05);R16组和R24组NF-κB、R16组的ASC和GSDMD以及R各组Caspase1蛋白含量分别低于其对应的C组(P<0.05)。(4)R组随训练时间的延长,细胞焦亡基因表达逐渐减少。对R16/C16和R32/C32组下调的差异基因Naip6和焦亡关键基因Casp1进行qPCR验证,与芯片结果一致。结论 32周负重跑训练可通过抑制骨骼肌细胞焦亡水平而缓解增龄大鼠肌肉丢失进程。

金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立及其在大鼠、小鼠粪便检测中的应用

目的建立一种快速灵敏的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)检测方法。方法选择金黄色葡萄球菌特异性基因nuc作为靶基因,设计并合成一对特异性引物和一条TaqMan探针,利用荧光定量PCR技术建立nuc基因的核酸检测方法,并在大鼠、小鼠粪便样本检测中进行应用。结果对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株中提取的DNA进行荧光定量PCR检测,结果显示金黄色葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非金黄色葡萄球菌未出现,表明设计的引物和探针对金黄色葡萄球菌检测具有特异性。将提取的金黄色葡萄球菌DNA进行10倍梯度稀释后测定其灵敏度,结果显示最低检出限是10 fg的DNA量,比普通PCR方法高2个数量级。本研究共检测91份样品,有4份来自同一设施的大鼠样品,扩增曲线为典型的S曲线;将该PCR产物测序并进行BLAST比对,该样本的基因序列与金黄色葡萄球菌的基因序列相似度为100%,表明该样本为金黄色葡萄球菌nuc基因核酸阳性,阳性率为4.40%,与细菌培养法的检测结果一致。核酸提取采用全自动核酸纯化仪,从核酸提取到检测结果判定快速,所需时间小于1.5 h。结论建立的以nuc为靶基因鉴定金黄色葡萄球菌的qPCR方法,具有快速、灵敏度高和特异性强的优点,可用于实验动物大鼠、小鼠粪便中金黄色葡萄球菌的检测。

基于多重PCR-LDR技术建立近交系大鼠单核苷酸多态性遗传检测方案

目的建立一套基于多重PCR-连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)技术的近交系大鼠单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)检测方案。方法在5个品系的SPF级近交系大鼠1~20号常染色体和X染色体上共选取40个大鼠SNP位点,将SNP位点随机分为4组,构建基于多重PCR-LDR技术的近交系大鼠4组SNP位点基因检测方案。采用本方案检测国内另两家大鼠供应商的9个常用大鼠品系。最后,通过第三方实验室对不同DNA聚合酶的扩增效果进行比对,验证本方案的可行性。结果用所构建的近交系大鼠SNP遗传检测方案测试5个大鼠品系时,各样本的所有位点均得到了良好的扩增结果。采用本方案检测国内另两家大鼠供应商的9个常用大鼠品系时也得到了良好的扩增结果,40个SNP位点在每个近交系大鼠中均为纯合。用3种来源不同的DNA聚合酶同时检测相同大鼠DNA样本的结果显示,Multiplex PCR Kit、AmpliTaq Gold^(TM)360 DNA聚合酶、PlatinumⅡTaq热启动DNA聚合酶在第1~3组SNP位点均有扩增产物的电泳峰,其中PlatinumⅡTaq热启动DNA聚合酶在第4组SNP位点中少了一个扩增产物的电泳峰。另外,不同实验室间的比对结果显示,相同扩增体系的检测结果一致。结论基于多重PCR-LDR技术成功建立了一套覆盖所有常染色体与X染色体的大鼠SNP检测方案,该方法的稳定性和重复性俱佳。

PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的 建立卡氏肺孢子虫 (P .c )DNA的聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定 (PCR ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。 方法 实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。 结果 两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96 4% (2 7/2 8)和10 0 % (2 8/2 8)。Giemsa染色镜检P .c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各 10份标本 ,均有 1只大鼠阳性。 结论 PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。

荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

【目的】研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异,克隆出与脑缺血相关的基因。【方法】应用荧光差异显示PCR(FDDPCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段,经反向Northernblot杂交,将杂交阳性的片段且经RT-PCR反复验证,选取差异明显的片段进行克隆测序;经生物信息学分析处理,选取同源性低的EST片段R6,利用cDNA5'端快速扩增PCR(5'RACE法)进行基因全长的克隆。【结果】利用5'RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区,扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF),RT-PCR及Northernblot印迹结果证实了克隆的结果,同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源,同源性96%,编码166个氨基酸,为结构及功能未明确蛋白质,该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q.13)。【结论】应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KIAA0280相似的基因,其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调,该蛋白质结构及功能均未见报道及研究,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。

肉及肉制品中大鼠成分PCR检测方法研究

我国肉类掺假现象屡禁不止,尤以使用来源不明的鼠肉冒充高价肉贩卖最为恶劣。褐家鼠(Rattus norvegicus)俗称大鼠,由于分布广、数量多、体型较大的特点最容易成为肉类掺假的来源。针对我国缺乏肉及肉制品中大鼠成分检测方法的问题,本研究针对包括大鼠在内的共17种动物线粒体cytb基因序列进行分析比对,设计特异性检测引物。该方法特异性好,可检出混合样品中低至0.1%的大鼠成分,灵敏度较高。结果表明,本方法对热处理混合肉样品和市售样品也具有较好的检测能力,灵敏度达到0.1%。本研究为肉类食品安全监管提供了新方法。

大鼠细小病毒H-1株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用

目的建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。方法根据NCBI发表的H-1(NC_001358)和KRV(U790330)基因组序列分别设计特异引物,以H-1和KRV病毒DNA为模板建立双重PCR方法,对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性;经口感染大鼠,分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组,感染后第2,4,6,8,10天采集大鼠粪便,第10天处死所有大鼠,采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织,用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带,敏感性验证显示能够检测到的最低H-1量为3.8 pg/m L,最低KRV量为0.73 pg/m L;在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出,特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸,感染大鼠均无明显临床症状,感染第10天采集组织,H-1在各组织的检出率分别是心50%(4/8),肝50%(4/8),脾62.5%(5/8),肺50%(4/8),肾37.5%(3/8),盲肠内容物62.5%(5/8),且单独感染组检出率高于混合感染组;KRV在各组织的检出率分别是心0(0/8),肝25%(2/8),脾87.5%(7/8),肺12.5%(1/8),肾25%(2/8),盲肠内容物62.5%(5/8),混合感染组检出率高于单独感染组。结论建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染,可作为实验动物国家标准的有力补充。

应用多重PCR检测屠宰猪扁桃体中的猪链球菌

从广东省部分地区肉联厂采集屠宰猪扁桃体401份,用两个多重PCR检测样品中猪链球菌(SS)及其主要致病血清型。检出SS阳性样品154份(38.4%),其中69份(17.2%)携带SS2,35份(8.7%)携带SS9,而SS7和SS1分别为9份(2.2%)和3份(0.7%)。不同血清型SS菌株可混合感染同一头猪,但比例均小于5%。在地区分布上,粤西地区SS阳性率(18.3%)明显低于其他地区(p<0.01),其余各地区之间均无显著差异(p>0.05),在35%～70%之间。对全部样品进行细菌分离,共分离到SS53株,分离率为13.21%;其中SS225株(6.23%),SS93株(0.75%),SS71株(0.25%),未定型SS24株(5.99%),细菌分离的阳性率远比PCR检测结果要低。此检测结果证实了华南地区猪群中广泛存在SS,并呈多个血清型混合感染,而且流行呈地域性的特点,凸显了SS流行的复杂性。

心肌缺血内皮素RT-PCR初步研究及其意义

目的为探讨心肌缺血后内皮素基因在心肌组织内表达的变化。方法用RT-PCR法研究了心肌缺血60min后心肌内皮素的表达情况。结果发现RT-PCR结果显示缺血组和正常组均检出ET-1mRNA,但是二者之间有显著性差异,说明缺血可以诱导ET-1mRNA增高。结论本实验为ET-1免疫组织化学法研究奠定了分子基础。

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的:制备NIDD基因TaqM an探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR(FQ-PCR),以进一步研究NIDD的表达情况。方法:采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区(CDS)片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度112 bp相符,DNA序列测序的结果与GeneBank提供的已知序列(AB098078)比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112 bp完全相同,与NIDD基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqM an探针。

实验大鼠和小鼠多种细菌PCR检测与分析

目的调查上海市实验动物生产设施大鼠、小鼠细菌携带状况。方法比较国内外实验动物细菌监测方案,选取螺杆菌、啮齿柠檬酸杆菌、牛棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌作为检测项目,分别于2014年和2016年收集样品共计848份,采用PCR方法对上述6种病原体进行检测。结果 SPF级设施均无金黄色葡萄球菌污染,清洁级设施2014年无肺炎克雷伯杆菌污染,其它病原体在不同级别设施内均有不同程度的污染,所有清洁级设施均存在螺杆菌和牛棒状杆菌污染。螺杆菌、啮齿柠檬酸杆菌和牛棒状杆菌在不同级别动物上均检出阳性。螺杆菌、绿脓杆菌阳性率呈下降趋势,而啮齿柠檬酸杆菌、牛棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌阳性率则呈上升趋势。结论本研究全面、系统地分析了上海地区实验大鼠、小鼠细菌携带状况,为提高实验动物质量和饲养管理水平起促进作用,为我国实验动物国家标准的修订和完善提供依据和参考。

限制性差异显示RT-PCR技术对大鼠脑缺血相关基因表达的研究

目的研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血与非缺血组织中基因表达的差异,以及差异表达基因随时间变化的规律,为临床寻找新的防治脑缺血的靶点奠定基础。方法采用线栓法制备大鼠不同时间脑缺血动物模型,采用限制性差异显示RTPCR技术(restrictiondisplayRTPCR,RDRTPCR),研究在大鼠局灶性脑缺血过程中差异基因的表达。结果在缺血后各时间点分别出现上调的EST片段有32条、下调的有13条。其中7条在缺血0.5、1.0、4.0小时均出现变化,分别系同一对引物所扩增且分子量相同,其在脑缺血中的表达具有一定的规律性。结论利用RDRTPCR技术成功获取了大鼠脑缺血过程中差异表达的基因,并揭示了部分基因在脑缺血过程中呈现的规律性变化,为进一步筛选、鉴定与克隆表达这些与脑缺血密切相关的基因,阐明脑缺血发病机制奠定基础。

鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。

大白鼠颌下腺促性腺激素释放激素受体(GnRHR)mRNA的RT-PCR和原位杂交的研究

本实验采用 RT- PCR法探讨大白鼠颌下腺是否存在 Gn RH受体 m RNA,并用原位杂交法对其细胞定位进行了研究。结果显示 RT- PCR可扩增出大白鼠颌下腺 Gn RH受体 m RNA的特异性片段 ,其碱基数与设计的一致。原位杂交发现颌下腺浆液性腺泡上皮细胞、颗粒曲管、排泄管及分泌管上皮细胞内有 Gn RH受体 m RNA的杂交信号。信号物质分布于胞质内 ,胞核阴性。上述结果表明大白鼠颌下腺能合成 Gn RH受体 ,颌下腺产生的 Gn RH可作用于颌下腺的靶细胞 ,参与颌下腺生理功能的调节。

荧光定量RT-PCR检测去下颌下腺大鼠睾丸annexin 5 mRNA和Bax mRNA的表达

目的观察下颌下腺切除对大鼠睾丸膜联蛋白5(annexin 5)和Bax mRNA表达的影响。方法切除大鼠下颌下腺,分别于术后14d、28d和42d处死大鼠,提取睾丸总RNA,反转录,设计特异性引物和Taqman探针,荧光定量RT-PCR检测annexin 5和Bax mRNA的表达。结果荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,切除下颌下腺14d和28d后,实验组大鼠睾丸annexin 5 mRNA分别升高了38.5%和55.3%,但无显著性差异;实验组大鼠睾丸Bax mRNA分别升高了70.6%和80.5%,其升高具有显著性差异(P<0.05和P<0.01);切除下颌下腺42d时,实验组大鼠睾丸annexin 5和Bax mRNA分别升高5.6%和2.3%,几乎恢复到与对照组相同的水平。结论下颌下腺切除后14d和28d可造成大鼠睾丸annexin 5和Bax mRNA的表达升高;切除后42d,annexin 5和Bax mRNA又恢复到正常水平。

实时荧光定量PCR检测大鼠VEGF mRNA方法的建立及初步应用

目的建立大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)实时荧光定量PCR检测方法,对健康大鼠不同组织中VEGF mRNA水平进行检测分析。方法跨内含子设计引物和TaqMan探针,扩增片段TA克隆入pGEM-T载体,制成标准品,分析其特异性、灵敏性和重复性;提取健康大鼠不同部位组织(肺、心、肝脏、肾脏、脑、胃、肠和颌下腺)总RNA,分析其VEGF mRNA表达水平。结果测序及电泳条带证实PCR反应的特异性,批内CV为2.0%～6.7%,批间CV值为3.5%～10.6%,r>0.99;肺组织中VEGF mRNA表达最高,与其他任意组相比差异均具有统计学意义(P<0.05),其它各组织间差异无统计学意义。结论本研究成功建立了检测大鼠VEGF mRNA的实时荧光定量PCR方法,具有高灵敏、高特异、高重复性的特点;健康大鼠不同部位组织中VEGF mRNA的表达水平分析为以后研究疾病大鼠模型表达水平奠定了基础。

实时RT-PCR定量检测NGF mRNA表达水平方法的建立

目的:建立一种用SYBR GreenⅠ实时定量逆转录(SYBR GreenⅠQ-RT-PCR)检测大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)mRNA基因表达的方法。方法:以Trizol一步法提取大鼠脑组织总RNA,以Oligo(dt)18为引物逆转录产生cDNA,利用SYBRGreenⅠ荧光染料法实时检测NGF mRNA的表达水平。通过熔解曲线分析NGF mRNA检测的特异性,以管家基因β-actin为内参照对NGF进行定量分析。结果:建立的大鼠NGF mRNA SYBR GreenⅠ实时检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立实时RT-PCR检测NGF mRNA基因表达的方法。

5-HT受体亚型mRNAs在大鼠三叉神经节和脊髓背根节的表达——PCR法研究

根据 5- HT受体 13种亚型互补 DNA序列合成相应的特异性引物 ,用 PCR方法对各种 5- HT受体亚型在大鼠三叉神经节及脊髓背根节的表达进行了观察。结果显示 :三叉神经节表达 5- HT1A、5- HT1B、5- HT1D、5- HT2 A、5- HT3、5- HT4 和 5- HT7亚型。背根节表达的 5- HT受体亚型与三叉神经节者相同 ,但这些亚型的电泳条带密度在两种神经节存在着差异。三叉节的 5- HT1D和 5- HT3电泳条带密度最高 ,5- HT1A和 5- HT4 次之 ,5- HT1B、5- HT2 A和 5- HT7较弱 ;背根节的 5- HT3和 5- HT1D电泳条带密度最强 ,5- HT1B和 5- HT2 A次之 ,而 5-HT1A、5- HT4 和 5- HT7则较弱。将各亚型的 PCR阳性产物进一步克隆至 p CR 载体进行序列测定 ,结果表明这些 PCR产物的 DNA序列与已知的各亚型的序列一致。本研究的结果对进一步探讨 5-

实时荧光定量PCR检测大鼠组织Angptl3表达的标准曲线构建

目的:采用实时荧光定量PCR(染料法)建立检测SD大鼠组织血管生成素样蛋白3(Angiopoietin-related protein3,Angptl3)表达量的标准曲线。方法:以SD大鼠肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR获得目的DNA片段,用T-A克隆方法将其装载到质粒pUCm-T上,经过转化、质粒提取获得标准品,并以此为模板梯度稀释进行Real-time PCR反应,建立该方法的标准曲线。结果:Angptl3标准曲线相关系数为0.9976,相关性较好;斜率为0.8623,扩增效率适中。结论:成功构建了用Real-time PCR方法检测SD大鼠肝组织Angptl3表达量的标准曲线。