五指山、二花脸和皮特兰猪的SLA-DRB基因外显子2PCR-RFLP及PCR-SSCP多态性分析

采用PCR RFLP法和PCR SSCP法对 1 7头五指山猪、2 8头二花脸猪以及 2 8头皮特兰猪SLA DRB外显子 2进行分型。采用PCR RFLP技术分型 ,结果显示 :限制酶MspⅠ酶切可分出 1种RFLP带 ,即M :1 4 3bp/ 1 0 2bp ;限制酶RsaⅠ酶切可分出 4种RFLP带 ,分别为A :1 4 1bp/ 93bp/ 1 1bp ,B :1 1 1bp/ 6 9bp/ 5 4bp/ 1 1bp ,C :1 80bp/ 5 4bp/ 1 1bp以及D :93bp/ 4 8bp/ 39bp/ 5 4bp/ 1 1bp。检测发现 ,五指山猪有 2种RFLP带型 :AA和BB ,二花脸猪有 3种RFLP带型 :AA、BB和AB ,皮特兰猪有 3种RFLP带型 :AA、CC和BD。比较五指山猪、二花脸猪与皮特兰猪 ,发现 3个品种都是以A带为主 ,分别占到 0 6 9、0 73和 0 82 ,品种之间差别不显著。采用PCR SSCP技术共分出 7种标记带型 ,分别为αα、αδ、ββ、γγ、αγ、δδ、βε ,其中五指山猪有 3种带型 ,分别为αα、αδ和 ββ ,二花脸猪有 3种带型 ,分别为αα、γγ和αγ ,而皮特兰则出现 5种带型 ,分别为αα、δδ、αδ、βε和 ββ。在 3个品种猪中均存在α带 ,且其频率在各自品种中均最高 ,在五指山猪和皮特兰猪中δ带出现的频率次之 ,相应的在这两个猪种中杂合型αδ带型出现的频率则最高。Hardy Weinberg平衡分析表明 ,二花脸猪SLA DRB基因外显子

PCR-SSCP法快速检测鉴定临床病原菌的探讨

目的 :探讨利用 PCR- SSCP快速检测和鉴别临床病原菌的方法。方法 :采用细菌保守的 1 6 s r RNA基因为模板 ,以 PCR-SSCP方法检测病原菌 ,并以普通 PCR法和 PCR- RFL P法作比较。结果 :普通 PCR法很难从电泳图谱中鉴别细菌 ;PCR-RFCP法电泳图谱虽呈多态性 ,但仍有部分细菌图谱相同和相似 ,不易区分 ;经 PCR- SSCP电泳出来的细菌图谱差异明显 ,可以互相区分。结论 :PCR- SSCP技术能快速简便地检测。

PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对常见食源性感染致病菌23S rDNA基因的鉴定

目的 探讨应用PCR RFLP和PCR SSCP进行食源性感染常见致病菌鉴定的可行性。方法 选择细菌 2 3SrDNA基因作为靶基因 ,设计合适的通用引物进行PCR扩增 ,对 13种食源性感染常见致病菌扩增产物的酶切片段进行RFLP和SSCP分析。结果 通用引物可以扩增出 13种食源性感染常见致病菌的 2 3SrDNA基因 ,HpaⅡ酶切产物的RFLP分析表明 ,不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱 ;SSCP分析表明 ,13种食源性感染常见致病菌SSCP图谱变异性更大 ,不利于种属间鉴别 ,但有利于种内的鉴定。结论 运用PCR RFLP和PCR

PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用

目的探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性。方法选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23 S rRNA基因作为鉴别靶基因,采用通用引物PCR(UP-PCR)进行扩增,并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP)。结果针对23S rRNA基因片段的Hpa II酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP分析显示,14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大,有利于进行细菌鉴定。结论运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定。

PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对弱精子症精子mtATPase6基因突变的检测

为了检测弱精子症精子mtATPase6基因突变,采用PCR方法扩增了17例弱精子症mtDNA8602～9416区域815bp目的片段,用MspI和HaeⅢ限制性内切酶酶切,分别用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和单链构像多态性(SSCP)筛查突变。筛选出3例突变标本,经测序确认突变位点和突变性质。结果显示17例标本全部扩增出mtDNA8602～9416的815bp目的片段,PCR产物经MspI限制性内切酶酶切后电泳结果与剑桥序列预期酶切图谱相一致。PCR产物经HaeⅢ酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上出现泳动带的异常,在17例弱精子症中共筛选出2例酶切片段异常标本。PCR-HaeⅢ酶切产物的SSCP电泳图谱分析结果显示,在PCR-RFLP(HaeⅢ)电泳图谱正常的15例弱精子症标本中筛选出1例异常。两种方法在弱精子症精子标本中筛选出mtATPase6基因突变3例(3/17,17.7%)。3例测序结果发现A8701G、C8943T、C8964T、T8966C、G9053A、C9060A、C9075T、A9120G、C9296T共9个点突变,其中A8701G、T8966C、G9053A三个突变为错义突变,其余均为同义突变。上述结果提示,弱精子症精子mtATPase6基因存在较高突变率;PCR-RFLP和PCR-SSCP能简单、快速、灵敏地筛选mtATPase6基因突变。

PCR-RFLP和PCR-SSCP在食源性感染致病菌检验中的应用

目的 探讨PCR-RFLP和PCR-SSCP在食源性感染致病菌检验中的应用。方法 将鉴别靶基因设定为食源性感染14种常见致病菌的23S rRNA基因,扩增时运用通用引物PCR(UP-PCR),并运用单链构象多态性分析(SSCP)和限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)分析PCR产物的酶切片段。结果 针对23S rRNA基因片段的Hpa II酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现的RFLP图谱相似;SSCP分析显示,SSCP图谱具有较大的变异性,能够为细菌鉴定提供有效依据。结论 PCR-SSCP技术能够快速鉴定食源性感染致病菌,值得在临床推广应用。

应用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术检测猪RN基因的研究

RN(Rendement Napole)基因是影响猪肉肉质性状的一个主效基因,已被定位在猪的15号染色体上(15q25),该基因在猪肉品质上存在严重的负面效应。应用限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析技术快速检测猪RN基因,根据R200向200Q突变的原理设计引物,PCR扩增后得到一段长约577bp的片段,两种方法得到相同的结果。

采用通用引物PCR配合SSCP和RFLP技术检测鱼病病原菌

采用通用引物PCR(UPPCR)、PCR RFLP、PCR SSCP技术 ,研究快速鉴别鱼病病原菌的分子生物学诊断技术。结果发现 ,采用细菌 16SrRNA基因保守区特异性引物 ,以嗜水气单胞菌、鲁克氏耶尔森菌、鳗弧菌、柱状曲挠杆菌、乙型链球菌、荧光假单胞菌等部分常见鱼病病原菌为对象 ,可以建立一种UPPCR技术。该技术能在保证实验条件不变的基础上 ,检出上述所有细菌 ,并还可检出大肠杆菌和双歧杆菌等非鱼病病原菌。并且认为 ,该法与SSCP配合即采用UPPCR SSCP技术能较好地鉴别被检菌而用于鱼病病原菌的快速诊断。

应用巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP对山东肾综合征出血热病人血清中HV基因检测和分型研究

目的探讨山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据。方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析。结果48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经HindIII、HinfI酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型。对部分扩增产物序列采用系统进化树分析也得出类似的结果:sdp1、sdp2、sdp3与HTN型76-118株亲缘关系相近,属同一簇,而sdp22、sdp37与SEOV型Z37、R22株亲缘关系相近,属另外一簇,这与RFLP和SSCP获得的结果相一致。结论山东肾综合征出血热重疫区病人基因型以SEOV型为主,但在秋冬季节也存在HTNV型。巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP法可对HV准确分型,而且简便、迅速,适合于大规模流行病学调查。

聚合酶链反应RFLP与SSCP检测伤寒杆菌DNA旋转酶基因变异

DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌药物作用靶位 ,其变异为细菌耐药主要原因之一。本文利用 PCR-RFL P、SSCP对伤寒杆菌 2 75 (临床分离敏感株 )及其自发耐药突变株 RG1 DNA旋转酶 A亚单位基因 (gyr A)耐喹诺酮类决定区进行检测 ,并以 DNA序列分析对该变异进行检测。结果表明 ,与伤寒杆菌 2 75相比 ,RG1 gyr A第 2 47位由 T变异为 G,相应于 DNA旋转酶 A亚单位第 83位氨酸由丝氨酸变为丙氨酸。Hinf 对PCR产物酶切分析表明有一 GANTC序列变异 ,SSCP则发现伤寒杆菌 2 75与 RG1 DNA电泳图象有明确差异。结果表明 PCR- RFL P、SSCP检测伤寒杆菌 gyr A变异快速、特异和灵敏。

中国柑橘黄龙病病原16SrDNA序列研究

运用PCR技术对来自中国7省区不同寄主上的黄龙病病原16SrDNA基因区进行了PCR-RFLP-SSCP分析,采用3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应,对酶切产物进行了单链构象多态性(SSCP)分析。结果表明:来自7省区不同寄主上9个黄龙病病原菌分离物的16SrDNA无可见变异;同时对9个有代表性的分离物16SrDNA进行了克隆测序,序列多重比对结果与PCR-RFLP-SSCP一致,从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病原菌的16SrDNA序列高度保守,在不同的地域、寄主内没有发现分子变异,为进一步研究柑橘黄龙病病原菌系统进化奠定了基础。

6个山羊品种高繁殖力候选基因BMP15多态性研究

骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic prote in 15,BMP15)基因为控制Belc lare和Cambridge绵羊高繁殖力的主效基因。采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术检测BMP15基因中与绵羊高繁殖力相关的两个突变位点在高繁殖力山羊品种济宁青山羊(130只母羊、20只公羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊30只母羊、文登奶山羊30只母羊、辽宁绒山羊30只母羊、内蒙古绒山羊50只母羊、北京本地山羊30只母羊)中的单核苷酸多态性,同时研究这两个突变位点对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明,在6个山羊品种中都没有检测到BMP15的B2突变(C→T);检测到的BMP15的B4突变(G→T)在6个山羊品种中均呈现杂合子状态。这表明BMP15基因中影响Belc lare和Cambridge绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。

微生物生态学研究方法进展

微生物培养及显微技术作为鉴定微生物种群的手段有很大的局限性 ,因为环境中大多数微生物处于“存活但不能培养”的状态。因此 ,不依赖于微生物培养的生物化学以及分子生物学方法正被广泛地用于微生物生态学研究。主要介绍了荧光技术 ,基于 PCR的分析技术和

猪黑素皮质素受体1(MC1R)基因与毛色表型的研究

猪的毛色表型虽然与经济性状没有直接相关 ,但它却对经济效益产生重要影响 ,在猪育种实践、商品猪生产等方面都有应用。结合PCR AccⅡ RFLP、PCR BspHⅠ RFLP及PCR SSCP技术 ,分析了 16个全同胞家系和金华猪、嘉兴黑猪、玉山黑猪、乐平花猪、上高两头乌猪及嵊县花猪等 6个地方猪种随机采样个体的黑素皮质素受体 1(MC1R)基因型。结果显示 ,地方猪种在MC1R位点携带高频率的显性黑等位基因ED1 ,表明我国地方猪种的黑毛色可能主要由显性黑等位基因ED1 调控。通过对嵊县花猪MC1R位点的分析 ,首次发现PCR SSCP证据的新序列 ,与已知的其他 5个等位基因带型不同。家系个体的分析结果进一步验证了ED1 对EP、e为完全显性 ,EP

FGF5基因对内蒙古绒山羊绒毛性状的影响

根据FGF5基因已知DNA序列设计了2对引物,采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术,在内蒙古绒山羊群体中进行基因多态性检测,结果发现FGF5基因外显子1存在限制性内切酶BglⅠ多态位点。对其不同基因型个体PCR回收产物进行测序,测序结果发现该SNP是由碱基序列C→T的突变而引起的。基因型和基因频率统计,该实验群体以等位基因A具有明显的优势,χ2检验表明该SNP位点的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态;对该SNP与绒毛性状关联分析,表明该SNP对绒纤维伸直长度(P<0.01)和含绒量(P<0.05)有显著影响,而对其他各绒毛性状的影响不显著(P>0.05)。AB基因型个体绒纤维伸直长度(P<0.01)和含绒量(P<0.05)显著高于AA基因型个体。

番木瓜环斑病毒株系的分子生物学方法鉴定

以 PRSV株系特异性引物对 PRSV的 PRSV12 6 (PRSV日本分离物 )、Ys、Vb和 Sm等株系进行 RT- PCR方法鉴定 ,引物 PR2 1/ PR2 2能把 Ys从 Vb和 Sm中鉴定出来 ,PR30 0 / PR30 1则能把 Vb从 Ys、Sm和 PRSV12 6中鉴定出来 ;用限制性内切酶 Hae II、Sau3A I和 Hinf I对 PRSV的PRSV12 6、Ys、Vb和 Sm等株系进行单酶切 RT- PCR- RFLP分析 ,Hinf I能把 PRSV12 6与 Ys、Vb和Sm鉴别开来 ,Sau3A I能把 Ys与 Vb和 Sm鉴别开来 ,Hae II则能把 Ys与 PRSV12 6、Vb和 Sm鉴别开来 ;以 P1/ P2为引物 ,对 Vb、Ys和 Sm株系进行 RT- PCR- RFLP- SSCP分析 ,结果能一次把三者较好地区别开来。

中国荷斯坦牛Toll样受体4基因的遗传多态性与体细胞评分的关联分析

试验旨在研究中国荷斯坦牛Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因的遗传多态性及其与体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关联性,寻找与乳房炎相关的分子标记,加快中国荷斯坦牛的抗病育种。利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛TLR4基因进行多态性检测,用最小二乘均数法对TLR4基因的多态位点与SCS进行相关分析。结果发现,试验共检测到2个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs),TLR4基因5′侧翼区存在SNP-226G>C突变,经PCR-RFLP检测发现3种基因型:GG、GC和CC,基因型频率分别为0.208、0.482和0.310;外显子3存在SNP 1760C>T突变,经PCR-SSCP检测发现3种基因型:CC、TC和TT,基因型频率分别为0.738、0.225和0.007,以上2位点均偏离Hardy-Weinberg平衡。对于SNP-226G>C位点,基因型个体的SCS差异不显著;对于SNP 1760C>T位点,CC基因型个体的SCS最小二乘均值极显著低于TT和TC基因型个体(P<0.01)。SNP 1760C>T的CC基因型对于中国荷斯坦牛的SCS有较大的遗传效应,可作为分子标记应用于奶牛乳房炎抗性筛选。

胃癌c－Ha－ras基因突变分析方法的建立及临床应用研究

本文应用多聚酶ＤＮＡ链延伸反应产物限制性酶切片段多态性分析（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）和单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）两种方法同时检测了２０例胃癌中ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因突变．本文显示ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ均是检ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因突变的简便、快速和敏感的方法，适用于临床大批量肿瘤标本的检测。

猪Pit-1基因的多态性研究

选取7个中国地方猪种和3 个国外引入猪种共473 头,应用PCR SSCP技术在7 个中国地方猪种中检测到1个Pit 1基因第4外显子上的突变;应用PCR RFLP技术在3个国外引入猪种中,扩增长度为1 747 bp的片段中检测到1个RsaⅠ限制性内切酶的多态酶切位点。遗传多态性分析结果表明:外显子4上的突变,在7个中国地方猪种中是A型等位基因和AA基因型频率占优势。其中沂蒙黑猪和巴马小型猪处于Hardy Weinberg平衡;北京黑猪、沂蒙黑猪、巴马小型猪、滇南小耳猪和香猪处于中度多态。RsaⅠ酶切多态位点的突变在3个国外引入猪种中也是A型等位基因和AA基因型频率占优势。其中大白猪和杜洛克猪处于Hardy Weinberg平衡;3 个国外引入猪种的多态信息含量均为中度多态。

阿勒泰羊BMP15基因的多态性

为寻找和筛选与羊繁殖力相关的遗传标记,采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术检测BMP15基因在阿勒泰羊中的单核苷酸多态性。结果表明:在检测的92个阿勒泰羊个体中,BMP15基因在外显子1位点呈多态性,具有AA、AB和BB 3种基因型。阿勒泰羊AA基因型频率为0.695,AB基因型频率为0.120,BB基因型频率为0.185。该段DNA序列存在3个碱基缺失,这个突变导致野生型(AA)氨基酸序列上相应的10号氨基酸残基亮氨酸缺失,变为突变基因型BB,形成B1突变体;在阿勒泰羊的BMP15基因中未检测到B2和B4突变。