猪瘟病毒PCR-ELISA检测方法的初步应用

猪瘟(classicalswinefever,CSF)是危害猪健康的重要传染病之一,具有急性、热性和高度接触性等特性,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCR-ELISA检测方法是在PCR和ELISA基础上创新的一种新技术,其灵敏性和准确性都高于单纯的PCR检测和ELISA检测。根据GenBank中猪瘟石门株序列,设计特异性引物,分别在5'端标记生物素和地高辛,经过PCR扩增后,加入到包被有链霉亲和素的ELISA反应板上,然后通过DIG-HRP抗体进行显色反应,建立PCR-ELISA检测方法。结果表明:PCR-ELISA最低检测到1.81×10^(4)拷贝/μL,普通PCR最低检测到1.81×10^(6)拷贝/μL,因此PCR-ELISA灵敏性比普通PCR高约100倍;对27份未知样品进行检测,普通PCR检测出阳性样品15份,阳性率为55.5%,PCR-ELISA检出20份阳性样品,阴性7份,阳性率为74%,阳性检出率增加18.5%;用建立的Real-TimePCR进行验证,检测结果与PCR-ELISA一致,两者的符合度为100%;然后用PK15细胞对普通PCR未检测出的阳性样品进行病毒分离培养,通过间接免疫荧光(IFA)及普通PCR检测,结果显示该5份样品均为阳性。说明本研究所建立的PCR-ELISA方法具有灵敏、特异、准确、快速、安全等优势,可应用于CSFV的快速诊断,为CSFV的流行病学监测提供有力保障。

PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用

目的 :介绍PCR -ELISA端粒酶活性测定方法 ,并对不同组织来源肿瘤端粒酶活性检测结果进行分析。方法 :采用PCR -ELISA端粒酶活性检测方法对299例不同组织来源肿瘤端粒酶活性进行检测。结果 :本组结果显示PCR -ELISA端粒酶活性测定方法在敏感性与特异性方面与国外报道的同位素方法结果一致。在多种人类恶性肿瘤组织中可检出端粒酶活性 ,而与各种肿瘤对应的正常组织及良性病变中则多为阴性。结论 :本组结果提示PCR -ELISA法为一高敏感的半定量评价端粒酶活性的方法 。

食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立

针对食品中金黄色葡萄球菌检测,选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶标,利用地高辛标记引物扩增的PCR产物与生物素标记的探针杂交,然后与ELISA平板上的链霉素杂交,通过抗地高辛抗体显色建立PCR-ELISA检测技术。应用该方法检测人工污染牛奶中金黄色葡萄球菌,同时将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌等常见食源性致病菌作为阴性对照。结果显示,金黄色葡萄球菌的纯培养物以及人工污染金黄色葡萄球菌牛奶,金黄色葡萄球菌为阳性,其他对照菌为阴性,两者PCR-ELISA检测敏感性均为10-1CFU/m L,比普通PCR检测的敏感性（10-3CFU/m L）高100倍。因此,该研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特异性与敏感性,能够特异、敏感、准确地检测牛奶中的金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄菌的快速鉴定、风险评估与有效监测提供重要技术手段。

应用PCR-ELISA技术检测转基因产品的研究

建立并优化了转基因大豆与玉米的DNA提取方法,针对CaMV35S启动子和T-NOS终止子的序列特点设计特异性引物与探针,应用PCR-ELISA检测技术,建立了转基因大豆与玉米中常用外源基因的快速检测体系,并应用于进出境产品的转基因检测实际工作中。结果表明,建立的PCR-ELISA法具有操作简便、灵敏特异、结果准确的优点,可对转基因大豆、玉米及其它转基因产品进行定性和定量检测。

空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立

针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5′端和核酸探针3′端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法。结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2 fg,敏感性是常规PCR的10倍。对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL。对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60%和69%。

用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因鱼

取含有小鼠重金属螯合蛋白 (mMT)基因启动子及人生长激素 (hGH)基因的鱼样品 ,以Qiagene核酸纯化技术对鱼组织DNA进行纯化。常规PCR检测显示 ,mMT启动基因和hGH基因的PCR产物分别为2 4 0bp和 130bp ,与设计相符。PCR产物的核酸测序结果证实其扩增产物具特异性。地高辛 PCR(Dig PCR)标记反应显示 ,2个基因均产生 1条Dig标记的特异产物带。Dig PCR ELISA检测敏感性试验显示 ,对mMT启动子和hGH基因的检测敏感性可达 10 - 3,与常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测方法相比 ,检测敏感性可提高至 10 0～ 10 0 0倍。试验证明 ,针对mMT和hGH基因所建立的Dig PCR

PCR-ELISA检测HBV DNA方法学建立及初步临床应用

建立PCR ELISA检测HBVDNA的方法学 ,探讨其最佳实验条件并初步评价其临床应用价值。常规PCR引物用地高辛标记 ,使扩增产物带有地高辛标记成份 ,再通过亲合素 生物素系统把生物素标记探针包被在固相聚苯乙烯板小孔中 ,通过固相探针与HBVDNA扩增产物进行杂交 ,与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应 ,经NPP显色 ,根据其A4 0 5nm值大小 ,推算样品中HBVDNA模板含量。建立PCR ELISA的最佳实验条件为PCR循环次数为 30次 ,杂交温度 37℃ ,杂交时间 1h ,批内变异系数为 9 4% ,批间变异系数 16 9% ,在 6 0例乙肝患者血清标本检出率为 70 % (4 2 /6 0 ) ,而常规凝胶电泳检出率为 46 7% (2 8/6 0 ) ,两者具有显著性差异 (χ2 =6 6 7 P<0 0 1)。

番茄环斑病毒HC-RT-PCR-ELISA检测

番茄环斑病毒 (ToRSV)是我国对外检疫一类有害生物 ,目前国内尚无存在的报道。PCR技术是一种快速灵敏的植物病毒检测方法 ,但核酸内的聚合酶抑制物会导致漏检现象 ,而只通过凝胶电泳进行结果判定会出现假阳性 ,这两方面限制了PCR技术在对外检疫中的应用。利用共价结合在PCR管壁上的引物特异性杂交诱捕核酸粗提液中的靶标核酸 ,洗掉杂质及抑制物质 ,在同一管内作RT PCR ,凝胶电泳检测液相产物的同时对固相产物进行杂交检测 ,提高了结果的可靠性及灵敏度。利用所建立的HC RT PCR ELISA成功地从法国进口葡萄苗中检出ToRSV。

PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的 建立卡氏肺孢子虫 (P .c )DNA的聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定 (PCR ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。 方法 实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。 结果 两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96 4% (2 7/2 8)和10 0 % (2 8/2 8)。Giemsa染色镜检P .c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各 10份标本 ,均有 1只大鼠阳性。 结论 PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。

PCR-ELISA用于HFRS病人早期诊断的研究

目的 建立检测HFRS患者血清标本中HV基因的PCR -ELISA方法。方法 设计并合成互补于HVS基因片段的标记引物 ,对 98例HFRS患者血清进行RT -nestedPCR扩增 ,并用酶免方法分析扩增产物。结果 98例患者不同病日采集的血清标本的RT -nestedPCR平均检出率仅为 6 0 .2 % ,而PCR -ELISA平均检出率为 80 .6 %。结论 PCR

免疫磁珠捕获联合PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法学研究

目的采用免疫磁珠捕获（IMC）联合双内标PCR-ELISA（IMC-PCR-ELISA）技术,建立定量检测结核分枝杆菌的方法。方法制备能够特异性捕获结核分枝杆菌的免疫磁珠（Dynabeads）。并根据结核分枝杆菌Mtp40基因序列以及结核分枝杆菌复合体群IS6110序列,设计2对特异性引物（上游引物的5′端用生物素修饰）,以及2条与PCR扩增片段等长的内参照片段（其与扩增模板在引物区的序列相同）和3套捕获探针（3′端用地高辛标记）。先通过免疫磁珠特异性捕获结核分枝杆菌,再联合双内标PCR-ELISA技术检测结核杆菌。结果采用IMC-PCR-ELISA技术定量检测结核分枝杆菌,全过程约4h,检测限为5×10^3 copies/mL,当低内标模板浓度在30-70copies/mL,高内标模板浓度在8 000-12 000copies/mL时,计算出的浓度与实际加入的目的模板浓度之间有良好的线性关系（r^2=0.998）,未发现非特异性反应。结论成功建立了IMC-PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法,此方法具有快速、灵敏、特异、可定量的特点。

检测弓形虫PCR-ELISA方法的建立

目的建立检测弓形虫DNA的快速、敏感、特异、稳定的PCR-ELISA方法。方法将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交,通过酶免疫显色反应测出A值,判断弓形虫感染情况。优化反应条件,测定方法的敏感性,并与琼脂糖凝胶电泳结果比较。以人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA为模板在同样条件下进行测试,以确定该方法的特异性。结果本实验的最佳杂交时间为30min,最佳探针浓度为3pmol/ml。该方法的检测阈值为20fg弓形虫DNA,其灵敏度是电泳法的10倍,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。结论PCR-ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法,可用于临床弓形虫病的诊断。

斑点叉尾鮰疱疹病毒PCR-ELISA检测方法的建立

针对斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)的ORF6基因设计引物和探针,PCR产物在扩增过程中标记地高辛,探针5′端用生物素标记,建立了CCV的敏感、快速、环保的PCR-ELISA检测方法。对反应条件进行了优化,并评估了该方法的特异性和敏感性。结果表明:该方法可特异性检测CCV DNA,与各对照均无交叉反应,具有高度特异性;该方法对CCV DNA的检测阈值为5 fg,敏感性是常规PCR检测方法的10倍。用此方法对人工感染样品进行检测,能够检测到感染组织中的CCV DNA。该方法能够定性和半定量检测CCV DNA,可用于斑点叉尾鮰疱疹病毒的检测、斑点叉尾鮰暴发性流行病的诊断。

PCR-ELISA法及荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV-DNA的探讨

目的探讨PCR-ELISA法及荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测HBV感染者精液中HBV-DNA检出情况及其临床意义。方法选取男性HBV感染者60例,采集患者精液、静脉血,用PCR-ELISA法来检测患者精液及血清中HBV-DNA。同时采用荧光定量PCR检测患者精液中HBV-DNA。结果PCR-ELISA法:60例精液标本HBVDNA阳性12例,阳性率18.33%,拷贝数为1.267×103-6.532×105/ml,平均拷贝数为4.781×104/ml;60例血清标本阳性53例,阳性率为88.33%,拷贝数1.462×103-5.153×107/ml,平均拷贝数为2.451×106/ml。荧光定量PCR法:60例精液标本HBVDNA阳性13例,阳性率21.67%,拷贝数为1.357×103-7.113×105/ml,平均拷贝数为4.983×104/ml;两种检验方法检测精液HBV-DNA的阳性检出率比较无显著性意义(P>0.05)。结论PCR-ELISA法与荧光定量PCR定量检测精液中HBVDNA同样具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解乙型肝炎患者精液中肝炎病毒的感染状态提供了帮助,具有重要的临床意义。

PCR-ELISA在转基因产品检测中的应用

PCR -ELISA法以共价交联在PCR管壁上的寡核苷酸作为固相引物进行PCR扩增 ,PCR产物通过杂交和凝胶电泳双重检测 ,结果通过酶标仪直接输出 ,无人为误差。该方法灵敏度高 ,可靠性强 ,易于操作 ,自动化程度高 ,适于批量检测 ,是适合推广的 1种快速转基因检测方法。

检测端粒酶活性的PCR-ELISA方法的建立

目的 建立一种更为敏感、特异的端粒酶检测方法。方法 将分子生物学和免疫学方法有机地结合起来，建立ＰＣＲＥＬＩＳＡ 方法并检测多种肿瘤细胞株和部分组织中端粒酶活性。结果 ＰＣＲＥＬＩＳＡ 方法能够敏感地检测出肿瘤细胞株和膀胱癌标本中端粒酶活性，膀胱癌标本中端粒酶的阳性率为８８－９％ ，对照组无１ 例阳性，其灵敏度为１０ ～１００ 个细胞，而且特异性良好。结论 ＰＣＲＥＬＩＳＡ 方法检测端粒酶活性是一种简便、快速、无放射性污染的方法，适用于肿瘤早期诊断和普查。

改良PCR-ELISA的建立及初步应用

目的 建立操作简单、灵敏、特异的PCR -ELISA。方法 采用短DNA片段扩增 ,其中上游引物 5′端标记有生物素 ,使PCR扩增产物的一条链上带有生物素 ,随着PCR反应的结束 ,PCR反应液中的地高辛标记的探针与PCR产物中的生物素标记的DNA链杂交 ,形成杂交产物 ,然后杂交产物通过生物素与微孔板上固定的链霉亲合素结合 ,被固定在微孔板上 ,最后用ELISA检测被固定的杂交产物。结果 该方法可以检测出 1× 10 1拷贝的HBVDNA模板 ,对 10 0例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBSAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清 10 0 %(30 /30 )检出HBVDNA ;HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清HBVDNA阳性为 78 6 %(2 2 /2 8) ;HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清HBVDNA阳性为 6 6 7%(16 /2 4) ,其余为阴性。非乙型肝炎血清的结果均为阴性。结论 该PCR -ELISA操作简单 ,方法灵敏、特异。

PCR-ELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用

目的 建立灵敏、快速、特异的 PCR- EL ISA检测结核菌 DNA的方法 .方法 用一对生物素标记的上游引物和未标记的下游引物对 TB IS6 110的一段 DNA进行快速 PCR扩增 ,使扩增产物的一条链上带有生物素 ,同时 PCR反应液中存在有地高辛的标记的检测探针 ,随着 PCR的结束 ,探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体 ,该杂交体通过链霉亲和素被固定在微孔板表面 .然后用标记有过氧化物酶的地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合 ,漂洗后加底物显色 ,测定吸光度值 (A4 50 nm) .结果 该方法灵敏、特异、快速 ,可以检测出 10 copies的模板量 ,对临床 6 0例痰标本进行检测 ,结果有 38例为阳性 ,有 2 2例为阴性 ,检出率不低于培养法 .结论 该方法适用于临床进行快速的 TB基因检测 ,也可用于其它病原体的检测 .

建立PCR-ELISA定量检测HBVDNA的技术

目的 建立一种敏感、特异和精确的乙型肝炎病毒基因PCR及其产物酶联杂交定量分析技术。方法 制备了一种与野生扩增片段等长的PCR内参照 ;设计了一对HBV基因组S区基因扩增引物 ,上游引物的 5′ 端用生物素修饰 ,可同时扩增长为 319bp的野生和内参照片段。两套捕获探针可分别与竞争PCR产物中的野生片段和突变片段杂交。在同一反应管内 ,加入已知量内参照及待测HBVDNA标本 ,进行PCR扩增 ,然后用酶联杂交法进行产物分析。根据Clementi等介绍的公式计算待测标本中的HBVDNA含量。结果 灵敏度达到 10 -3fmol/L。在该法中 ,由于有PCR过程中的特异引物及酶联杂交过程的特异探针两个环节的限制 ,因此具有很高的特异性。结论 竞争PCR及其产物酶联杂交定量法是一种相对精确、灵敏度很高和特异性较强的HBV基因全定量测定技术 ,优于外参照法及其它产物定量法。