应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析

目的探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值。方法采用聚合酶链反应-单链探针反向杂交试验技术,PCR扩增50株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析。结果 PCR-LiPA方法分析50株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP菌株中检出4株,耐INH菌株中检出5株,耐SM菌株中检出7株,SM敏感株检出1株,50株rrs基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB菌株1株、EMB敏感株1株检测到embB基因突变。结论应用PCR-LiPA可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段。

建立以lipA和purH为靶基因的RTQ-PCR方法对水稻白叶枯病菌侵染过程进行定量分析

【目的】建立水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的分子定量法,测定Xoo侵染水稻植株后不同时间的种群量及其变化【。方法】选用以lipA和purH为靶基因序列的引物P4和P5,用SYBR Green I实时定量PCR(RTQ-PCR)分析在水稻接种植株内的病菌种群量。【结果】与细菌平板计数法相比,RTQ-PCR法定量结果基本相近或略高(≤10倍),变化趋势基本相似,用2对引物P4和P5进行RTQ-PCR定量无显著差异。接种3d的植株内己有菌量积累,但不显症;从接种5d开始,细菌明显增加,植株显症并逐渐加重;接种9～14d菌量增加到峰值,并进入稳定平台期,植株显症严重。病菌种群量与植株显症间的关系可能与细菌群体感应机制有关。【结论】用RTQ-PCR分子定量法可以直接对水稻植株内的Xoo进行动态定量研究;提出了水稻病害分子定量"病菌靶基因拷贝数-DNA总量-种群量-植物病症"的研究模式。

结核杆菌耐药性调查与基因突变分析

目的了解结核分支杆菌耐药性与基因突变情况,分析耐药表型与基因突变的相关性。方法从临床标本中分离培养、鉴定结核分支杆菌;应用药敏试验、单链探针反向杂交试验技术(LiPA)和基因测序分析结核分支杆菌耐药性与基因突变情况。结果50株结核分支杆菌中,12株耐异烟肼(INH),7株耐利福平(RFP),15株耐链霉素(SM),2株耐乙胺丁醇(EMB)。LiPA检测耐RFP菌株,4株rpoB基因531位TCG→TTG突变;耐INH菌株中5株KatG基因315位AGC→ACC突变;耐SM菌株中6株、SM敏感株1株rpsl基因43位AAG→AGG突变,1株耐SM菌株rpsl基因88位AAG→AGG突变;rrs基因未检测到突变;1株耐EMB菌株与1株EMB敏感株的embB基因306位发生ATG→GTG突变。结论本市结核分支杆菌的耐药性增加的趋势显著,加强监测与综合干预非常必要。

单链探针反向杂交试验快速检测结核分支杆菌5种耐药基因

目的:建立可同时检测结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB基因突变的单链探针反向杂交试验技术(PCR-LiPA),评价该技术检测结核分支杆菌利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药性的应用价值。方法:采集临床标本,按照实验规程培养、鉴定结核分支杆菌,并对分离到的结核分支杆菌进行药敏试验;PCR扩增结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB耐药基因,单链探针反向杂交试验技术检测耐药基因。将PCR-LiPA结果与DNA测序比较验证方法的准确性,将PCR-LiPA结果与药敏结果比较,了解结核分支杆菌耐药性表型与耐药基因突变的相关性。结果:50株结核分支杆菌传统药物敏感性试验结果显示,12株耐INH,7株耐RFP,15株耐SM,2株耐EMB。PCR-LiPA方法分析结果:耐RFP菌株中4株rpoB基因突变;耐INH菌株中5株KatG基因突变;耐SM菌株中7株、SM敏感株1株rpsl基因突变;耐EMB菌株1株、EMB敏感株1株embB基因突变。与DNA测序结果的符合率为100%。结论:用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌耐药株的rpoB、katG、rpsL、rrs、embB基因突变,可用于临床结核分支杆菌耐药性的辅助诊断手段。

特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因分型法的建立及应用

目的应用型特异性引物聚合酶链反应法(PCR)进行乙型肝炎病毒基因分型并分析该法的可靠性。方法应用型特异性引物PCR和INNO-LiPA分别对深圳、长春、北京152份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行了基因型分型,对该两种分型法不一致的血清标本再进行S区基因测序分型,以确定该两法的可靠性。结果型特异性引物PCR和INNO-LiPA的总符合率为86．8％(132／152),不一致率为13．2％(20／152)。型特异性引物PCR检测到81份(53．3％)B型;58份(38．2％)C型;13份(8．5％)B+C型混合感染,未检出其他基因型或混合感染的基因型。INNO-LiPA检测到74份(48．7％)B型;61份(40．1％)C型;5份(3．3％)B+C型混合感染;另检出3份(2．0％)A +B型混合感染;1份(0．7％)B+E型混合感染;1份(0．7％)C型与D型,1份(0．7％)D型感染,3份(2．0％)B／C／D型及3份未能分型。20份两法分型不一致的标本中,6份无剩余血清,对其余14份进行了S区基因测序分型,结果型特异性引物PCR与S区基因测序分型法的符合率为71．4％(10/14),而INNO-LiPA与S区测序法的符合率仅为7．1％(1／14),前者明显高于后者(P<0．05)。结论型特异性引物PCR和INNO-LiPA均可鉴定HBV基因型,但前者较为简便和可靠,且费用较低,可用于临床标本的检测和流行病学调查。