半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

云南汉族HLA-DRB1多态性分析及与9个汉族群体的比较

应用聚合酶链反应—微孔板杂交 (PolymeraseChainReactionandMicrotitrePlateHybridization ,PCR MPH)的方法对云南 12 9个无亲缘关系的汉族样品进行了HLA DRB1的遗传多态性分析 ,对MPH初分出的DRB1 15组的样品进行了单链构象多态 (Single StrandConformationPolymorphism ,SSCP)检测。共发现 36种等位基因 ,其中等位基因频率大于 0 0 5的有DRB1 15 0 1(0 12 4 0 ) ,DRB1 0 90 12 (0 0 96 9) ,DRB1 0 80 32 (0 0 930 ) ,DRB1 12 0 2(0 0 891) ,DRB1 12 0 1(0 0 814 ) ,DRB1 14 0 1(0 0 775 ) ,DRB1 0 70 1(0 0 6 2 0 )。云南汉族HLA DRB1等位基因频率与中国其他 9个汉族群体进行 χ2 检验 ,结果显示与云南汉族比较 χ2 >10的有西安汉族 (DR8,χ2 =13 9712 )、上海汉族 (DR4 ,χ2 =10 16 32 )、广东汉族 (DR9,χ2 =12 6 12 1)和南京汉族 (DR4 ,χ2 =10 5 796 )。从遗传距离分析发现 ,在 9个国内汉族群体中云南汉族与辽宁汉族有最近的距离 (0 0 5 4 1) ,而与广东汉族最远 (0 185 1)。云南汉族在构成上可能与辽宁汉族更为接近 ,尽管地处南方 ,但已不属典型的南方汉族。这也可能因云南汉族与当地的少数民族存在基因交流 。

三种疟原虫检测方法的比较研究

应用聚合酶链反应 (PCR)及微滴度板杂交试验 (MPH)对来自高疟疾流行区、收集于滤纸片的 112例干血滴样品进行检测 ,并对同一人群作镜检进行比较。结果表明显微镜检查恶性疟原虫检出率 2 7.6 9% (31/ 112 ) ,而PCR及MPH方法检出率分别为 37.5 % (4 2 / 112 )、5 0 % (5 6 / 112 )。实验结果提示镜检虽然简便、易行、成本低 ,但由于一般观察极限的限制 ,影响了检出率。PCR方法敏感、特异 ,疟原虫检出率较高 ,但有假阳性及假阴性 ,且无法作种属鉴定。三种方法中MPH方法恶性疟原虫检出率最高 ,不仅可进行种属鉴定 ,也可进行混合感染的检测。此法疟原虫检出率 71.43% (80 / 112 ) ,其中混合感染者为 39.2 9% (4 4/ 112 )。但该法的结果难以被其它方法证实。表明该法特异性尚待证实 ,加上MPH成本高 。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 建立半巢式聚合酶链反应 微孔板杂交法 (半巢式PCR MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感。半巢式PCR MPH法特异性强 ,检测敏感性高 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 10倍 ;该法重复性好 ,批内CV值 <10 % ,批间CV值 <15 % ;该法在包被浓度为 4mg/L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 10pmol/ml探针杂交 30min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、特异性好、敏感性高、结果判断客观 ,无放射性和EB染料污染 ,便于大量临床样本的常规检测。