人类血小板抗原HPA-15系统PCR-SSP基因分型技术的建立

本研究目的是采用PCR-SSP技术建立人类血小板抗原HPA-15系统的基因分型方法,并应用于血小板供者库的HPA基因定型。采用第11届国际输血协会(ISBT)血小板血清学与基因分型协作组推荐的序列特异性引物,调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-15系统基因分型技术。该分型技术的准确性和可靠性,采用第11届ISBT血小板协作组提供的质控样本进行验证,同时采用本研究合成的引物及商品化试剂盒,对50名随机的汉族血小板捐献者进行HPA-15系统基因分型,作为平行对照。应用本研究的方法,对第11届ISBT送检的10份考核样本进行基因分型。结果表明:基因分型结果与ISBT公布的结果完全一致。50名随机的血小板志愿捐献者,经本研究的方法及美国G&T公司的试剂检测,基因分型的结果相符合;观察到的基因频率:HPA-15a和-15b分别为0.5100和0.4900。结论:本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景。

血小板特异性抗原(HPA)的PCR-SSP基因分型研究

血小板是最常用的血液成分之一，在临床上具有重要意义。血小板特异性抗原（Ｈｕｍａｎｐｌａｔｌｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｏａｎｔｉｇｅｎｓ，ＨＰＡ）是人类血小板所独有的抗原系统。目前ＨＰＡ的检测，包括其相应抗体的检测，主要还是血清学方法。但血清学试验有很...

人类血小板同种抗原HPA-1、HPA-2、HPA-3和HPA-5的实时PCR基因分型优于标准的PCR-SSP方法

诸如血小板输注无效、输血后血小板减少性紫癜以及胎母同种免疫性血小板减少症等患有同种免疫性血小板减少症病人，人类血小板同种抗原(}tPA)基因分型对其诊断和治疗是有益的。作者采用基于TaqMan技术的实时聚合酶链反应(PCR)方法，通过最优化筛选及有效性测验，

血小板HPA-3,HPA-15基因分型微滴式数字PCR检测体系的构建

目的建立血小板HPA-3,HPA-15基因分型的微滴式数字PCR(ddPCR)高灵敏检测方法,并初步探索应用于孕妇外周血胎儿游离DNA HPA抗原相容性检测的可行性。方法针对HPA-3,HPA-15的SNP突变位点,设计特异性引物及MGB探针,优化ddPCR退火温度及引物浓度等扩增条件,建立最佳反应体系,明确检验程序。对该检测方法进行方法学性能评估包括特异性、灵敏度、重复性和稳定性。利用ddPCR技术对2022年6月至2023年6月67例临床血液标本进行检测,将等位基因分型结果与基因测序结果比较,并对52例母体外周血胎儿游离DNA HPA抗原进行检测。结果检测血小板HPA-3,HPA-15的ddPCR方法,引物及探针特异性良好,HPA-3,HPA-15的最佳退火温度分别为:61.6℃,60.2℃;体系最佳引物浓度分别为:900 nM,700 nM;探针终浓度均为250 nM。拷贝数定量检测范围为:2~20000 copies,检测下限为0.1 copies/μL且线性良好。在低拷贝数标本中,HPA-3及HPA-15实际检测值的批内及批间变异系数(CV)均<5%。对67份人血液标本DNA的HPA-3,HPA-15基因型检测,结果与基因测序结果完全一致。应用于胎母血小板HPA-3,HPA-15基因型检测结果符合预期。结论本研究构建的HPA-3,HPA-15 ddPCR检测体系准确性高,重复性及稳定性较好,灵敏度高,可应用于临床血小板HPA-3,HPA-15基因型供者库的建立、基因配型及胎母血小板相容性检测等。

南昌地区血小板供者HLA-A、B和HPA基因多态性分析及分型库的建立

目的通过对血小板捐献者HLA-A、B和HPA 1-6,10,15,21基因位点的检测,分析基因位点分布特点,加强南昌地区血小板供者资料库的建设,保障临床血小板输注的有效性、及时性,提高临床输血疗效。方法对南昌地区800位血小板捐献者血样,采用荧光定量PCR的方法,对HLA-A、B位点、HPA 1-6,10,15,21位点进行基因分型,计算基因频率和基因型频率。结果HLA-A、B位点共检出HLA-A、HLA-B等位基因45个,其中HLA-A等位基因16个,频率较高的有A2、A11、A24;检出HLA-B等位基因29个,频率较高的有B13、15、B40、B46。HPA 1-6,10,15,21位点不配合率较高的是HPA3和HPA15,除此之外不配合率均低于10%。结论南昌地区人群与其它汉族地区HPA-HLA基因多态性类似。考虑其它汉族地区基因资料库计算结果和南昌ABO血型分布频率,资料库总人数需要达到7000人才能比较好的满足患者需求。

HPA配型在免疫性血小板输注无效中的应用研究

目的探讨以HPA配型解决免疫性血小板输注无效的方案。方法 1)建立PCR-SSP方法检测HPA-1～5基因型检测方法,建立机采血小板供者库;2)采用微柱凝胶法和Capture-P法对32名血小板输血无效患者作血小板同种抗体筛查,并对2种方法比较;3)对血小板同种抗体筛查阳性患者采用已知HPA基因型的标准谱血小板作抗体鉴定并采取HPA基因型同型输注的原则寻找供者。结果 1)采用PCR-SSP方法成功检测出HPA-1～5基因型,并对1 000名血小板供者的HPA-1～5基因型定型;2)32例血小板输注无效病例中,微柱凝胶法检测血小板同种抗体阳性率为50%,Capture-P法血小板抗体阳性检出率为40%;3)32例血小板输血无效病例中2种方法同时血小板抗体阳性13例,其中2例鉴定为抗-HPA,分别为抗-HPA-5b(P=1/84)、抗-HPA-1a(P=1/55)。结论对抗-HPA引起的血小板输注无效患者采用HPA基因型相合的方法寻找供者是有效的。

广州地区无偿献血者HPA-1—6,15基因分型及频率调查

目的研究人类血小板基因多态性,为人类群体遗传学研究及临床输血实践提供重要数据和依据。方法通过PCR-SSP方法对广州地区706名无偿献血者的HPA1—6,15系统进行基因分型,并统计其频率。结果706份样本中HPA-3和-15基因型的杂合程度最高,其a/a、a/b、b/b的频率分别为HPA-3:0.2918、0.4830、0.2252;HPA-15:0.2691、0.5170、0.2139,不配合率较高,均达到35%以上。HPA-1、-2、-4、-5系统均以a/a纯合子为主,a基因的频率范围为0.9583—0.9993,且均未发现b/b纯合子。1b、4b的基因频率很低,分别为0.0028和0.0007。本地区的HPA-1a与中国北方、英国白人、美国黑人有统计学差异(P<0.05)。HPA-2与中国南方、北方、美国黑人和日本人有统计学差异(P<0.05);HPA-5与英国白人和美国黑人存在统计学差异(P<0.05)。HPA-6频率分别为0.9575,0.0397,0.0028。结论本研究对广州地区HPA献血员的筛查可为建立HPA供者库和对探讨由HPA引起的免疫性疾病的预防和治疗提供相关数据和研究手段。

中国大陆地区发现一例罕见的血小板抗原HPA-10bw等位基因报告

采用序列特异性引物-聚合酶链式反应(PCR-SSP)为基础的人类血小板抗原(HPA)基因分型技术做群体调查,在1,000例受检者中发现1例罕见的HPA-10w(a+b+)杂合子个体,为了验证分型的可靠性,使用PCR反应特异性扩增HPA-10基因片段,然后测序分析。结果表明,nt263位G→A导致GPⅢa糖蛋白第62位精氨酸(CGA)→谷氨酰胺(CAA),产生HPA-10bw抗原特异性。在中国人群中检测出HPA-10bw低频抗原,提示在血小板同种免疫引起的新生儿同种免疫血小板减少症(NAIT)、输血后紫癜症(PTP)以及血小板输注无效症(PTR)的诊断中,该抗原具有临床意义。

大连地区汉族人群血小板捐献者HPA基因多态性研究

目的对大连地区汉族人群血小板捐献者HPA-1～17基因多态性进行分析,建立本地化的血小板捐献者HPA分型资料库。方法应用PCR-SSP技术,对257名大连地区45岁以下的汉族无血缘关系的血小板捐献者HPA1～17系统基因进行分型。结果大连地区汉族人群血小板捐献者的HPA基因频率如下:1a和1b分别为0.9728和0.0272;2a和2b分别为0.9475和0.0525;3a和3b分别为0.6615和0.3385;4a和4b分别为0.9942和0.0058;5a和5b分别为0.9805和0.0195;6a和6b分别为0.9767和0.0233;7a和7b分别为0.9981和0.0019;9a和9b分别为0.9961和0.0039;11a和11b分别为0.9805和0.0195;13a和13b分别为0.9961和0.0039;14a和14b分别为0.9981和0.0019;15a和15b分别为0.5584和0.4416;HPA-8、10、12、16、17只检测到a位点。经χ2检验,符合HW定律。结论 HPA基因多态性分布存在明显的种族和地域性差异。大连地区HPA基因分布有其独自的特点,其中HPA-3和HPA-15系统不配合率最高,在输血和免疫上具有重要的免疫学意义。

长春地区无偿献血者HPA1-6,15基因分型及频率调查

目的调查北方汉族人群人类血小板抗原(HPA)的基因频率及分布规律。建立一支HPA-1a,-2a,-4a,-5a,-6a阴性及已知HPA抗原的献血者队伍。方法随机抽取172名长春地区固定无偿血小板捐献者静脉血3ml,枸橼酸钠抗凝;采用TIANGEN试剂盒提取DNA。基因定量仪测定DNA的浓度和纯度。采用PCR-SSP方法进行试验。最后进行统计学分析。结果各表现型的频率分别是:HPA-1aa 0.988,HPA-1ab 0.012,HPA-2aa 0.833,HPA-2ab 0.159,HPA-2bb 0.008,HPA-3aa 0.355,HPA-3ab 0.482,HPA-3bb 0.163,HPA-4aa 0.988,HPA-4ab 0.012,HPA-5aa 0.971,HPA-5ab0.029,HPA-6aa 0.977,HPA-6ab 0.023,HPA-15aa 0.286,HPA-15ab 0.498,HPA-15bb 0.216。未发现HPA 1bb、4bb、5bb、6bb。各基因型的频率分别是:HPA-1a 0.994,HPA-2a 0.913,HPA-3a 0.596,HPA-4a 0.994,HPA-5a 0.985,HPA-6a 0.988,HPA-15a 0.535。其中基因频率占99%以上的有HPA-1a-、4a。各基因型的不配合率分别是HPA-1a 0.011,HPA-2a0.147,HPA-3a 0.366,HPA-4a 0.011,HPA-5a 0.028,HPA-6a 0.023,HPA-15a 0.374。结论本研究有助于在长春地区建立已知HPA抗原的机采血小板捐献者队伍,可以提高血小板抗体的检出率,为同种免疫性血小板减少症患者提供HPA相合的血小板。

吉林地区人群HPA-1～6,15系统基因多态性分析

目的调查吉林地区人群人类血小板抗原（HPA）基因多态性。方法采用PCR-SSP方法对419名血小板捐献志愿者进行血小板抗原HPA-1-6,15系统基因分型,通过统计方法对分型结果进行基因多态性分析。结果血小板抗原HPA-1-6,15系统基因频率分别为HPA-1aa 0.984,HPA-1ab 0.016,HPA-2aa 0.872,HPA-2ab 0.123,HPA-2bb 0.004,HPA-3aa 0.350,HPA-3ab 0.483,HPA-3bb 0.166,HPA-4aa 0.992,HPA-4ab 0.008,HPA-5aa0.996,HPA-5ab 0.004,HPA-6aa 0.984,HPA-6ab 0.016,HPA-15aa 0.318,HPA-15ab 0.492,HPA-15bb 0.190。结论吉林地区人群HPA-1-6和HPA-15系统基因多态性具有本地区特点,HPA-3和HPA-15系统不配合率最高,HPA-2系统次之。

PCR-SSP在人类血小板抗原1—6、15系统基因分型中的应用

目的探索PCR-SSP技术在人类血小板抗原(HPA)-1、2、3、4、5、6、15系统的基因分型中的应用。方法合成23条序列特异性引物,通过调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-1—6、15系统同步扩增基因分型方法。用该法盲检100名献血者HPA-1—6、15系统的基因分型结果,与用美国G&T公司的HPA-1—6、15系统的基因分型试剂所测试的这100名献血者的基因分型结果进行比较。结果该分型方法和美国G&T公司试剂同时检测100名随机献血者,其HPA-1—6、15分型结果完全一致,符合率达100%,基因频率分别是:HPA-1a和1b为1和0,HPA-2a和2b为0.98和0.02,HPA-3a和3b为0.63和0.37,HPA-4a和4b为0.997和0.003,HPA-5a和5b为0.997和0.003,HPA-6a和6b为1和0,HPA-15a和15b为0.548和0.450。结论该分型方法具有简便、快速、准确的特点,适合常规HPA基因分型。

血站单采血小板献血者HLA和HPA基因型数据库的调查和分析

目的 调查分析国内血站系统单采血小板献血者HLA和HPA基因型数据库情况,以促进其建库发展和应用。方法 制定调查表并经专业人员审定,培训调查人员后依据实际情况填写表单,然后收集数据进行分析。结果 调查的24个血站中,有18个建立了血小板献血者HLA和HPA基因型数据库,合计有25 240人;2017年HLA或HPA基因型配合应用总共为137例。有5个血站建立了CD36抗原阴性筛查数据库。入库标本进行了HLA-A,-B位点检测,而HPA系统检测范围不同血站存在差异,其中9个血站只检测HPA 1-6, 15, 21w系统。13个血站采用聚合酶链反应核苷酸特异性引物技术检测HPA系统基因型。13个血站开展HPA抗体检测,6个血站开展CD36抗体检测。结论 血站已建立一定规模的单采血小板献血者HLA和HPA基因型数据库,但其应用存在明显不足。

张家口地区机采血小板捐献者HPA分型研究

目的:分析河北省张家口地区血小板捐献者血小板特异性抗原HPA1-5,15系统的基因多态性。方法:采集血小板捐献者静脉血并提取DNA,采用聚合酶链-序列特异性引物(PCR-SSP)法进行血小板特异性抗原分型,计算基因频率、基因型频率并与国内外其他地区进行比较是否存在差异及是否表现地区特异性。结果:HPA-1、HPA-2、HPA-4系统中基因表达均为纯合子aa,未出现表达纯合子bb的存在者,其中HPA-1和HPA-4系统各发现杂合子ab表达1例(1%),HPA-2系统发现杂合子ab表达14例(14%);HPA-5系统基因表达主要为纯合子aa(98%),极少数表达纯合子bb(2%);HPA-3和HPA-15系统基因表达杂合程度较高,HPA-3系统基因表达aa、ab、bb表达比例分别为46%、40%、14%,HPA-15系统基因表达aa、ab、bb表达比例分别为21%、64%、15%。结论:张家口地区血小板特异性抗原HPA1-5,15系统基因频率具有本地区特点;HPA-3和HPA-15系统基因表达杂合程度较高,引发同种免疫及血小板输注无效的可能性较大,因此应引起注意。