南方番茄病毒在海南省的发生分布及全基因组序列分析

病毒病是海南番茄生产中危害最严重的病害之一,在利用小RNA深度测序技术鉴定海南番茄病毒病病原时发现,南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)在海南省多个市(县)的样品中存在,而且发现1株STV单独侵染的样品。为了解STV在海南省的发生分布情况,利用RT-PCR技术,对2015—2021年采自海南省的987份疑似病毒侵染的番茄叶片样品进行检测,结果表明:在9个市(县)的142份样品中检测到STV,早在2015年STV就已经在海南番茄上存在,检出率从2015年(8.82%)到2021年(22.45%)呈逐年上升趋势。同时结合RACE和RT-PCR技术扩增到4个STV海南分离物的全长基因组,长度均为3446 nt,包含2个部分重叠的ORFs,ORF1(147~1280 nt)和ORF2(1048~3336 nt)分别编码p42蛋白(377 aa)和RdRp蛋白(762 aa),5′UTR和3′UTR的长度分别为146 nt和110 nt。序列一致性分析表明,4个STV海南分离物间基因组序列一致性为99.86%~100.00%,与目前GenBank公布的所有STV分离物基因组间序列一致性为98.45%~99.94%。基于全基因组序列构建的系统发育树显示,80个STV分离物被明显分为2个组(组Ⅰ和组Ⅱ),组Ⅰ包括亚洲、美洲、欧洲和非洲分离物;组Ⅱ中除1个亚洲分离物外,其他均为欧洲分离物;4个海南分离物被分在组Ⅰ,STV分离物的分组与地域呈一定的相关性,而与寄主无相关性。4个海南分离物与组Ⅰ分离物基因组序列变异度较高的区域位于881~1061 nt和1521~1721 nt,与组Ⅱ分离物基因组序列变异度较高的区域位于2041~2241 nt和2761~2921 nt。STV分离物基因组间未发现重组事件。这是在海南省首次报道发现STV。本研究结果有助于了解STV在海南省的分布、发生趋势及遗传多样性,为病害防控提供科学依据。

转基因本氏烟草中CtDXR基因拷贝数及耐盐耐高温功能的初步分析

评估转基因本氏烟草中CtDXR基因的拷贝数,并初步分析其耐盐与耐高温能力。首先利用Southern Blot技术确定野生型本氏烟草中Actin基因的拷贝数,并以Actin基因为内参基因,以转CtDXR基因本氏烟草为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测转基因植株中CtDXR基因的拷贝数。最后,初步分析转基因植株的耐盐与耐高温能力。基于PCR方法,随机检测10株T1代转基因本氏烟草植株均能扩增出目的条带,表明它们均已成功转入目的基因CtDXR;Actin基因在本氏烟草基因组中为单拷贝基因;以Actin基因为内参基因,最终确定80%的转CtDXR基因植株为单拷贝或低拷贝株系;盐胁迫下,转CtDXR基因植株的株高(P<0.01)、侧根数(P<0.01)与鲜重(P<0.001)优于野生型植株,高温胁迫下,转CtDXR基因植株的株高(P<0.01)、叶片数(P<0.01)与鲜重优于野生型植株,表明转基因植株具有更强的耐盐和耐高温能力。利用研究建立的转基因本氏烟草外源基因拷贝数的检测方法,对转CtDXR基因植株完成外源基因拷贝数的鉴定,且初步鉴定了CtDXR基因具有耐盐与耐高温功能。

基于PCR和巢式PCR技术的玉米南方锈病早期检测

【目的】建立巢式PCR方法,快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌(Puccinia polysora),为玉米南方锈病(southern corn rust)的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列,在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R,建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系:Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL~(-1))0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)plus)2μL,d NTP Mixture(各2.5 mmol·L~(-1))1.6μL,上下游引物(10μmol·L~(-1))各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH_2O。扩增程序:利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环;72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍,取1μL用作第二步PCR的扩增模板,然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环;72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增,扩增体系同巢式PCR,扩增程序除循环数为38,其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、青杨叶锈病菌(Melampsora laricipopulina)和7种玉米常见病原菌进行特异性检测,对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。【结果】巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时,产生了255 bp的目的条带,其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg·μL~(-1),是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500—2.5×10~4个多堆柄锈菌夏孢子时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%,巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1 000个;当1 g人工接种病叶中含1—7个夏孢子堆时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%,常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个,巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆;当1 g人工接种病叶中含1—7个侵染点时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%,检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。【结论】成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法,可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。

PEX法提取植物组织DNA

介绍了一种简单而实用的DNA提取法,利用PEX试剂从高粱与转基因玉米的新鲜叶片中提取植物组织DNA。所得DNA经定量检测后,可满足AFLP分析及PCR-Southern杂交等要求。

甘蔗线虫病抗性基因的PCR检测研究

以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的保守序列区域,分别设计了2条上游引物2、条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用PCR特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物。用抗根结线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约460 bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约690 bp大小的特异片段,进一步进行了PCR-Southern杂交,确认了该2条特异引物的真实性。

欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白嵌合基因的研究

以欧美杨108号为外植体材料,利用农杆菌介导法成功地将抗虫基因(蜘蛛杀虫肽+B t毒蛋白的嵌合基因)导入受体中。通过PCR检测,凝胶电泳结果显示8个卡那霉素抗性芽中,6个存在目的基因;经PCR-Southern印迹杂交检测,阳性率为50%,进一步表明目的基因成功整合到欧美杨108号基因组内。

美洲拟鲽抗冻蛋白基因遗传转化草莓的研究

以草莓品种星都2号和全明星的无菌苗叶盘和叶柄基部为外植体,采用携带美洲拟鲽编码pre、pro和mature3种抗冻蛋白(AFP)基因的双元载体系统的根癌农杆菌进行转化,获得7个Km抗性株系。经PCR扩增及PCR-Southern杂交检测,6个株系呈阳性,结果表明,编码pre、pro和mature的AFP基因分别整合到了星都2号和全明星染色体DNA中,其中获得pre、pro和mature转星都2号株系各1个,转化率分别为1.56%、1.49%和1.67%;mature基因转全明星株系3个,转化率为4.05%。

ACC合酶反义基因转化洋桔梗Double Mariachi Pink的研究

以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)品种Double Mariachi Pink为试验材料,在已建立的洋桔梗高频再生体系和高效稳定遗传转化体系的基础上,将PBI121-ACC合酶反义基因片段(1 008 bp)通过农杆菌介导法转化洋桔梗,通过高频再生获得116株抗性苗。再生抗性苗在生根培养基1/2MS+NAA 0.1 mg/L+Km 15 mg/L上生根筛选获得了55株正常生根的植株;对其中随机挑选的8个株系进行PCR鉴定和GUS表达检测,在增殖筛选培养基MS+6-BA0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Km 30 mg/L+Cb 100 mg/L上初步筛得到5个PCR阳性株系,其中4株GUS检测呈阳性:5个PCR阳性株系经PCR-Southern杂交鉴定得到1株阳性植株。将阳性株系出瓶移栽,其平均花期为24 d。

简单、快速、高效扩增和标记目的基因技术的研究

从固体平板挑取转化带有目的基因的单菌落 ,用特异引物通过聚合酶链式反应可直接扩增和标记目的基因 ,不需经过菌的液体培养、质粒提取和酶解反应等复杂过程 ,能快速获得目的基因扩增产物和进行目的基因探针的标记。

南瓜子房注射法遗传转化的研究

以南瓜品种银辉1号为受体材料,用子房注射法对148个南瓜子房进行aiiA基因的遗传转化处理,共收获115个单瓜,结实率为77.7%。随机抽取56个单瓜,经0.2%Basta水溶液筛选和PCR鉴定,鉴定出7株阳性植株,均来自1个单瓜。再经PCR-Southern Blot鉴定,结果显示均有杂交信号,表明aiiA基因已经整合到银辉1号南瓜基因组DNA中,转化率为0.25%,单瓜转化率为6.36%。

ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构

目的 了解大熊猫肠道微生物区系结构的相似性和稳定性,并找出大熊猫肠道微生物群落结构的变化与健康状况的关系。方法 对上海动物园及上海野生动物园所饲养的3只大熊猫2次采集的粪便样品进行微生物群落总DNA的抽提,并以此为模板获得反映肠道微生物群落结构特征的ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱,比较各DNA样品指纹图谱的相似性指数。结果 除国庆(大熊猫)的第1次采集的样品(当时处于腹泻状态) ,其他各DNA样品的ERIC- PCR及Southern杂交指纹图谱的相似性都达到85 %～10 0 % ;佳斯及川川(大熊猫) 2个个体2次采集的样品之间ERIC指纹图谱的相似性分别为93%和87% ,而国庆腹泻时的样品与健康时的样品之间则为71%。结论 大熊猫不同个体之间肠道微生物群落结构比较相似,而且同一个体在不同时期表现出比较高的稳定性,但当个体的健康出现问题时肠道优势菌菌群结构有一定波动。所采用的DNA提取方法、ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱的高度重复性证明了之一分子生态学技术在大熊猫肠道微生物区系动态监测中的可行性。

富含多糖的转基因石斛基因组DNA提取方法(英文)

在石斛兰转基因研究中,需通过PCR和Southern杂交等手段检测外源基因是否转入并整合到转化植株基因组。由于转化石斛植株生长缓慢,且含有多糖,因此从转化植株中提取高质量的基因组DNA以尽快对转基因苗进行分子检测存在较大困难。本研究旨在通过改良现有的DNA提取法(CTAB法或SDS法),克服转化石斛植株基因组DNA提取中碰到的产量低,纯度不高而导致难以进行PCR或酶切等问题。在本研究所用的3种改良法中,方法Ⅱ能从少量的转化石斛苗中提取出高产量和高纯度的基因组DNA。研究结果表明方法Ⅱ提取的基因组DNA完全适用于转基因石斛的外源基因PCR扩增,限制性酶切和Southern杂交分析。

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应 (PCR) ,Southern杂交和 RT-PCR检测。结果 PCR和 Southern杂交检测结果表明 ,外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中 ,RT-PCR结果表明其 DNA可以正常转录成 m RNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。

黄鳝单条染色体的显微分离及特异性检测

建立了显微分离黄鳝单条染色体及检测其特异性的方法。在Olympus倒置显微镜下用毛细玻璃微针手工分离黄鳝减数分裂Ⅰ终变期 3号染色体 ,将其DNA作模板进行DOP PCR扩增后 ,分别以α-3 2 P dCTP和Biotin 11 dUTP标记的单条染色体DNAPCR扩增产物及Biotin 11 dUTP标记的大豆 18SrRNA基因作探针进行Southern杂交、FISH和Dot杂交来检测其特异性。结果表明 :(1)减数分裂Ⅰ终变期染色体标本是进行染色体显微操作的理想材料 ;(2 )DOP PCR扩增产物片段在 2 0 0～ 10 0 0bp之间 ,平均 6 0 0bp左右 ;(3)杂交结果显示 ,本研究所获得的单条染色体是黄鳝 3号染色体 ;(4 )与显微操作仪和微激光分离相比较 ,该方法不需要昂贵仪器 ,在常规实验室即可操作 。

农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立

以南瓜金辉一号(Cucurbita moschata' Jinhui1')为实验材料,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化南瓜子叶节,研究了预培养时间、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间,抗生素羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)以及筛选剂卡那霉素(Kan)等因素对离体不定芽的影响,建立了南瓜最适遗传转化体系。结果表明:外植体预培养0天,侵染时间30分钟,AS浓度为100mg·L-1,共培养5天可获得最高遗传转化效率;最适除菌剂为Cef,其最适浓度为500mg·L-1;最适Kan筛选浓度为100mg·L-1;在MS培养基上培养抗性芽生根,经PCR和Southern blot检测,证明为转基因植株。

农杆菌介导法获得优良玉米自交系转Bt基因植株

用根癌农杆菌介导法将携带有苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bt)和PPT乙酰转移酶基因(bar)的质粒pGBIL04导入优良玉米自交系340和4112经预培养的幼胚初始愈伤组织,抗性植株平均发生频率为11.21%,经PCR、PCR-Southern和Southernblotting检测证明外源基因Bt已稳定整合到13株玉米基因组中,平均转化率为2.35%。降低共培养温度到22℃的转化率最高达4.44%,Basta抗性检测bar基因也同时转移进再生植株中,部分转化植株已经结实。

不结球白菜晚抽薹BcFLC3基因的克隆及表达分析

根据大白菜BcFLC3基因(GenBank登录号AY036890.1)保守域序列设计引物,扩增不结球白菜晚抽薹BcFLC3基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因1 017 bp的全长cDNA序列。序列分析结果表明,该cDNA包含完整开放阅读框,编码197个氨基酸的蛋白质,其分子量为21.62 kD,等电点9.36。荧光定量PCR分析表明,不结球白菜经4℃低温处理后,BcFLC3基因在叶片中的表达量抽薹前明显高于抽薹后;低温处理后BcFLC3基因在不同部位的表达量存在明显差异,表达量由高到低依次为叶、茎、花蕾、花和根。Southern杂交结果表明,Bc-FLC3基因在不结球白菜基因组中为多拷贝。

胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杧果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传。随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起;进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入。

转Hu-IFN-α基因草鱼的分子验证及抗性研究

采用显微注射法将人α-干扰素抗病基因转移到草鱼受精卵中 ,获得转基因群体 ,通过 PCR及 Southern杂交对转基因草鱼进行分子水平的检测 ,以进一步验证外源人α-干扰素是否整合入草鱼基因组 .结果表明 ,外源人α-干扰素抗病基因已整合入草鱼基因组中 .采用腹腔注射法 ,对转基因鱼进行草鱼出血病病毒接种攻毒试验 。

表达Xa21基因的转基因水稻研究

对Xa2 1在转基因水稻新汕B后代R1、R2 群体的遗传方式及稳定性进行初步分析 .特异PCR分析从分子水平表明Xa2 1基因已稳定遗传至R1代 ,自交R1代的抗感带型分离比为 3:1,揭示出Xa2 1基因在转基因水稻中按孟德尔方式遗传 .Hyg培养基发芽和田间接菌鉴定显示 ,Xa2 1转基因水稻对Hyg和白叶枯病的抗性多数在后代中出现3:1的分离 ,对白叶枯病的抗病性呈连续分布 ,能传递至较高世代 ,并且能在R2 代获得纯合株系 .图 3表 3参