深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652遗传操作系统的建立

目的建立深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652菌株的遗传操作系统,通过基因阻断研究次级代谢产物的生物合成途径。方法在对该菌株的全基因组进行测序的基础上,以基因组序列中编码非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPSs)的基因s102-A和s63-A为目标基因,利用PCR-targeting介导的基因置换技术构建了重组质粒,在加有3%海盐的培养基上,通过ET12567/pUZ8002属间接合转移导入SCSIO 00652野生菌。结果接合子通过一代、二代松弛培养都无法得到双交换突变菌株,松弛培养四代后经抗性筛选,双交换率明显提高,PCR分析结果显示s102-A基因和s63-A基因均被成功阻断,HPLC分析结果显示突变株的发酵产物与野生型菌株有一定的差异。结论成功建立了深海放线菌M.thermotolerans SCSIO 00652的遗传操作系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础。

产N-demethyl ECO-0501工程菌的构建

ECO-0501是一种在东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)中分离出的一种新型抗菌化合物。N-demethyl ECO-0501作为ECO-0501生物合成途径的小组分在抗菌活性方面优于ECO-0501。ECO-ORF5(ABM47006.1)编码N-甲基转移酶,负责ECO-0501胍基的甲基化修饰。本研究利用PCR-targeting的方法敲除了产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10162的ECO-ORF5,得到了一株高产去甲基ECO-0501的突变株A.orientalis HCCB10370,其产量是东方拟无枝酸菌HCCB10162的3.6倍。

南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819遗传操作系统的建立

目的建立南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819菌株的遗传转化系统,通过基因阻断方法来研究次级代谢产物的生物合成途径。方法分别以整合型载体pSET152和用于同源重组的、包含可能参与大环多烯类化合物生物合成的DNA片段的非复制型cosmid质粒,通过大肠杆菌—链霉菌属间接合转移导入Streptomyces sp.OUC6819之中。结果通过在接合转移过程中对菌丝体进行超声破碎,成功获得了正确的接合子。采用PCR方法验证了pSET152的导入和目标基因orf1的阻断,进一步对突变株的发酵产物进行了HPLC分析,结果显示突变株丧失了合成大环多烯类化合物的能力。结论成功建立了基于菌丝体超声破碎的海洋链霉菌遗传转化系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础,也为其它不便进行遗传操作的链霉菌提供了参考。

通过阻断调控基因ygrA挖掘海洋链霉菌OUC6819中抗MDR菌活性次级代谢产物

目的激活南海红树林来源链霉菌Streptomyces sp.OUC6819菌株中不表达或表达量低的隐性生物合成基因簇,挖掘具有优良多重耐药菌(MDR)抗菌活性的次级代谢产物。方法通过生物信息学分析推测Streptomyces sp.OUC6819基因组中可能的GntR家族调控子,采用PCR-targeting策略敲除其中的ygrA基因,HPLC分析突变株和野生株的发酵产物的差异,并比较粗提物对5株MDR菌抑制活性。结果 HPLC分析结果表明与野生株相比,突变株中化合物1和化合物2产量分别提高了9倍和7倍;突变株发酵液粗提物对其中3株MDR菌抑制活性较野生株明显提高。结论通过阻断GntR家族调控子ygrA激活了Streptomyces sp.OUC6819菌株中具有抗MDR菌活性次级代谢产物合成基因簇的表达,为从中发掘新的抗MDR菌抗生素奠定了必要基础;同时,将为其他海洋链霉菌中隐性基因簇的激活提供重要参考。

杀稻瘟菌素生物合成基因簇的边界确定

【目的】杀稻瘟菌素(BS)是六元糖环肽核苷类抗生素,在农业和基因工程方面有重要应用。由于在其原始产生菌中很难进行基因操作,且许多合成步骤未知,为了增加对此基因簇的认识,为后续生物合成途径的推导和改造提供更多依据,在变铅青链霉菌中确定该基因簇的边界,并对blsK基因功能进行初步研究。【方法】利用PCR-targeting法对已测序基因簇中的基因进行基因置换得到突变株,LC-MS检测突变株发酵液的产物从而确定基因置换是否影响杀稻瘟菌素的产生。【结果】明确了杀稻瘟菌素基因簇包含blsD–blsM共10个基因;在blsK的基因置换突变株中检测到去甲基杀稻瘟菌素(DBS)和少量杀稻瘟菌素的积累。【结论】blsD–blsM这10个基因负责杀稻瘟菌素的生成;从blsK的突变株产物积累结果推测,BlsK蛋白负责加载亮氨酸到DBS的精氨酸衍生侧链的β-氨基上,生成N-亮氨酰化去甲基杀稻瘟菌素(LDBS);BS生物合成途径有两条,一条是由DBS直接甲基化生成BS;另一条是由DBS转化成LDBS继而由LDBS甲基化和水解生成BS。

稀有放线菌Lechevalieria rhizosphaerae NEAU-A2的次级代谢产物研究及遗传操作系统的建立

【背景】菌株Lechevalieria rhizosphaerae NEAU-A2是一株新的稀有放线菌,其基因组中包含多个与次级代谢产物生物合成相关的基因簇,具有产生丰富代谢产物的潜力。【目的】对稀有放线菌L.rhizosphaerae NEAU-A2的次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并建立其遗传操作系统。【方法】应用硅胶柱色谱和高效液相色谱等方法对菌株NEAU-A2的次级代谢产物进行分离和纯化,整合质谱分析、核磁共振等方法进行结构解析。在对该菌株全基因组测序的基础上,以基因组序列中编码杂合的聚酮合酶-非核糖体肽合成酶(PolyketideSynthase-Nonribosomal Peptide Synthetase,PKS-NRPSs)基因1609为目标基因,利用PCR-Targeting介导的基因置换技术构建重组质粒,通过接合转移的方式导入野生菌株。【结果】从菌株NEAU-A2中分离鉴定了2个新的吲哚二聚化合物(1,2)和5个已知化合物N-乙酰色胺(3)、4-((2-(1H-Indol-3-Yl)Ethyl)Amino)-4-Oxobutanoic Acid(4)、Brevianamide F(5)、4S,7R-Germacra-1(10)E,5E-Diene-11-Ol(6)、1H-吡咯-2-羧酸(7)。接合子通过培养2代即可获得双交换突变菌株,PCR分析结果显示PKS-NRPS基因被成功中断。【结论】从稀有放线菌L.rhizosphaerae NEAU-A2中分离鉴定出7个化合物,并成功建立了该菌的遗传操作系统。

海洋来源链霉菌OUCMDZ-3434中wblA基因的功能

【背景】Streptomyces sp. OUCMDZ-3434分离自山东青岛栈桥浒苔样品,其次级代谢产物Wailupemycin类化合物具有良好的α-糖苷酶抑制活性,但产量很低,影响了其进一步研发。【目的】建立海洋来源链霉菌Streptomyces sp. OUCMDZ-3434菌株的遗传转化系统,通过阻断全局性调控基因wblA探究Wailupemycin类化合物产量变化。【方法】以p SET152为载体,采用大肠杆菌-链霉菌属间接合转移策略建立了Streptomycessp.OUCMDZ-3434的遗传转化方法。采用PCR-Targeting策略构建了wblA基因阻断突变株,通过HPLC分析野生型和突变株发酵产物的差异并对表型差异进行显微形态观察。【结果】建立了Streptomyces sp. OUCMDZ-3434遗传转化系统,构建了wblA基因阻断突变株,与野生株相比,突变株发酵产物中Wailupemycin G产量提高了3倍,同时丧失了产生孢子的能力。【结论】在Streptomycessp.OUCMDZ-3434中wblA对Wailupemycin类化合物生物合成起到了负调控作用,同时参与调控孢子形成,本研究为采用遗传改造策略提高Wailupemycin G产量提供了参考。

一种适用于链霉菌异源合成基因簇同框缺失的高效方法

【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段,通过分析突变菌株积累的中间产物,可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上,对每个基因进行同框缺失耗时耗力,因此,优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法,实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记,同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法,在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比,构建同框缺失载体的效率明显提高;Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。

Streptomyces sp.NO1W98中杀黑星菌素的分离和生物合成基因簇的鉴定

【目的】分离Streptomyces sp.NO1W98中的杀黑星菌素并鉴定其生物合成基因簇。【方法】利用有机溶剂萃取法对Streptomyces sp.NO1W98放大规模发酵产物进行提取;以正向、反向色谱柱层析进行化合物的分离纯化;借助波谱学手段进行单体化合物的结构鉴定;采用Illumina Hiseq技术进行基因组序列测定,对得到的序列进行生物信息学分析、注释并定位杀黑星菌素的生物合成基因簇vtd,利用基于PCR-targeting的遗传操作系统构建vtd内相关基因的阻断突变株,同时利用pSET152AKE进行基因回补,并分析与野生菌株的发酵产物差异。【结果】从NO1W98发酵产物提取物中初步分离鉴定了2个大环内酯类化合物杀黑星菌素A(1)和B(2);NO1W98的基因组大小约为11.6 Mb,蕴涵49个次级代谢产物生物合成基因簇,其中scaffold 3上的Region 3.3可能负责杀黑星菌素的生物合成;基因阻断和回补实验初步鉴定了杀黑星菌素的生物合成基因簇,包含6个骨架基因、5个转运基因、2个调控基因以及9个后修饰基因。【结论】杀黑星菌素的分离、结构鉴定和基因簇的鉴定以及生物合成途径的推导为其遗传改造和工程菌株的构建奠定了分子基础。