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An ELISA Based on a Truncated Soluble ORF2 Protein for the Detection of PCV2 Antibodies in Domestic Pigs 被引量:4
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作者 Shuang-hui YIN Shun-li YANG Hong TIAN Jin-yan WU You-jun SHANG Xue-peng CAI Xiang-tao LIU 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2010年第3期191-198,共8页
Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) is an important swine disease that is closely associated with porcine circovirus type 2 (PCV2). The capsid protein (Cap protein) is a major structural protein that has... Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) is an important swine disease that is closely associated with porcine circovirus type 2 (PCV2). The capsid protein (Cap protein) is a major structural protein that has at least three immunoreactive regions, and it can be a suitable candidate antigen for detecting the specific antibodies of a PCV2 infection. In the present study, an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (TcELISA) based on a truncated soluble Cap protein produced in Escherichia coli (E.coli) was established and validated for the diagnostic PCV2 antibodies in swine. The TcELISA was validated by comparison with an indirect immunofluorescence assay (IIFA). The diagnostic sensitivity (DSN), specificity (DSP), and accuracy of the TcELISA were 88.6%, 90.7% and 89.4%, respectively. The agreement rate was 89.38% between results obtained with TcELISA and IIFA on 113 field sera. A cross-reactivity assay showed that the method was PCV2-specific by comparison with other sera of viral disease. Therefore ,the TcELISA will be helpful for the development of a reliable serology diagnostic test for large scale detection of PCV2 antibodies and for the evaluation of vaccine against PCV2 in swine. 展开更多
关键词 Porcine circovirus type 2 pcv2 Soluble ORF2 protein ELISA Antibody detection
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猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备
2
作者 孙荣航 容芳 +2 位作者 陈桂娥 刘郁夫 陈瑞爱 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第14期61-67,73,126,共9页
为了制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)Cap蛋白单克隆抗体,试验将Cap基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将获得的重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)用IPTG进行诱导后表达重组蛋... 为了制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)Cap蛋白单克隆抗体,试验将Cap基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将获得的重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)用IPTG进行诱导后表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;将纯化后的重组蛋白于皮下免疫Balb/c小鼠,免疫结束后测定免疫小鼠血清效价,当小鼠血清抗体效价达到1∶100000时进行细胞融合;采用有限稀释法进行亚克隆,筛选能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性杂交瘤细胞株,鉴定杂交瘤细胞株抗体亚类,并选择1株抗体效价最高的细胞株再次注射到小鼠腹腔中(5×10^(5)个/只),取腹水采用亲和层析法对单克隆抗体进行纯化;采用间接ELISA方法测定单克隆抗体效价并检测其特异性,分别采用Western-blot和间接免疫荧光试验检测单克隆抗体的反应性。结果表明:PCR扩增得到大小为708 bp的Cap基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-Cap;重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)经诱导后表达的重组蛋白可与His标签抗体发生特异性反应,纯化后的重组蛋白在预期位置(31.7 ku)出现清晰的单一条带;共筛选出8株能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性单克隆细胞株(1E5、2A9、3C6、4B3、5F7、6D11、7A2、8G1株),抗体亚类鉴定均为IgG1亚类。其中7A2株抗体效价最高,用于单克隆抗体的制备;间接ELISA方法证实7A2株单克隆抗体仅与PCV-2 Cap蛋白发生反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)不发生反应;Western-blot和间接免疫荧光试验均证实PCV-2 Cap蛋白可被7A2株单克隆抗体特异性识别。说明本试验成功制备出具有高纯度、强特异性、良好反应性的PCV-2 Cap蛋白单克隆抗体。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(pcv-2) 单克隆抗体 CAP蛋白 细胞融合 亚克隆
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PCV2b衣壳蛋白C端连接不同B细胞表位对其免疫原性的影响 被引量:1
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作者 刘晴坤 冯华 +3 位作者 任春晓 魏蔷 刘运超 张改平 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期233-238,共6页
为了研制廉价高效的猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗,根据大肠杆菌密码子的偏好性合成PCV2b(GenBank:AY969004.1)cap基因全序列,利用PCR技术,分别将PCV2的2个B细胞表位(226LKDPPLNP233和195HVGLGTAF202)以单独和串联的方式连接到Cap的C端... 为了研制廉价高效的猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗,根据大肠杆菌密码子的偏好性合成PCV2b(GenBank:AY969004.1)cap基因全序列,利用PCR技术,分别将PCV2的2个B细胞表位(226LKDPPLNP233和195HVGLGTAF202)以单独和串联的方式连接到Cap的C端,成功构建至pE-SUMO表达载体,将3个重组载体转化表达菌株BL21(DE3)后诱导表达,经SDS-PAGE分析和Western Blotting鉴定,3种重组蛋白均以可溶形式表达且表达正确。对3种重组蛋白分别进行镍柱亲和层析纯化,再用SUMO蛋白酶除去融合标签,获得无标签的Cap-e1、Cap-e2和Cap-e12蛋白,并分别与相应的弗氏佐剂等体积乳化,将20只6周龄大小的雌性Balb/c小鼠随机分成5组,分别免疫3种重组蛋白,同时设置疫苗组和PBS组作为对照组,并进行免疫评价,比较C末端连接的不同B细胞表位对Cap免疫原性的影响。抗体检测结果表明,除第2周外,各试验组的抗体水平均显著高于PBS组,且连接2个表位的Cap-e12蛋白产生的抗体水平高于只连接1个表位的蛋白(Cap-e1、Cap-e2),而在第6周时,Cap-e12蛋白抗体水平与疫苗组无显著差异。综上Cap的免疫原性与连接表位数量有关,连接2个表位后能显著提高Cap的免疫原性。 展开更多
关键词 猪圆环2型病毒 小分子泛素相关修饰物 衣壳蛋白 B细胞表位 免疫原性
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PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因转录水平的变化
4
作者 朱艳平 刘佳 +5 位作者 何勇 岳锋 李文明 郭东光 孟广超 王选年 《湖南农业科学》 2021年第4期7-11,共5页
为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白能否模拟PCV2在体外刺激外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),使猪白细胞介素21(interleukin-21,IL-21)和IL-17A基因转录水平发生变化,试验根据IL... 为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白能否模拟PCV2在体外刺激外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),使猪白细胞介素21(interleukin-21,IL-21)和IL-17A基因转录水平发生变化,试验根据IL-21和IL-17A的基因序列,设计引物,利用实时荧光定量PCR检测IL-21和IL-17A基因的转录水平。为进一步分析IL-21和IL-17A转录调节的机制,研究还通过实时荧光定量PCR检测了PD-L1的转录水平。结果表明:PCV2 Cap蛋白和PCV2在体外均能刺激PBMCs,导致IL-21、IL-17A和PD-L1基因的转录水平升高,其中PCV2 Cap蛋白导致的IL-21基因转录水平升高更多,几乎是PCV2刺激时表达量的2倍,IL-17A基因的转录水平基本和PCV2刺激时保持一致;PCV2 Cap蛋白能模拟PCV2刺激PD-L1基因转录水平发生变化,但是与PCV2感染时转录水平变化趋势并不完全一致,PCV2刺激时PD-L1的转录水平更高,预示着PD-L1基因与IL-21和IL-17A基因的转录可能存在一定的调节关系。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2 CAP蛋白 外周血单核细胞 IL-21 IL-17A PD-L1 转录水平
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抗PRRSV和PCV-2-Cap蛋白特异性IgY抗体对保育猪生长和免疫的影响 被引量:1
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作者 鲍伟华 周雪荣 +4 位作者 卢黎明 孙鹏烈 樊莉 方维焕 李肖梁 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期74-79,共6页
应用特异性抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白卵黄免疫球蛋白(IgY)饲喂保育猪,观察其对保育猪生长和免疫性能的影响。经抗体检测表明,53日龄时,PRRSV和PCV-2抗体阴性率0.5%,试验组比对照组分别高15%... 应用特异性抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白卵黄免疫球蛋白(IgY)饲喂保育猪,观察其对保育猪生长和免疫性能的影响。经抗体检测表明,53日龄时,PRRSV和PCV-2抗体阴性率0.5%,试验组比对照组分别高15%和5%。在53日龄和60日龄时,保育猪PRRSV阳性抗体S/P均值,试验组比对照组分别低15.59%和24.53%。保育猪46日龄-60日龄之间,阳性PCV-2抗体S/P均值试验组比对照组分别低15.42%、19.66%和12.70%。保育猪转栏时,试验组比对照组平均末重高12.74%(P〈0.01),平均日增重提高16.90%(P〈0.01),成活率高1.67%。免疫组化结果显示,相对于空白组,添加组空肠和小肠组织中的PRRSV抗原的阳性表达几乎为0。试验结果为特异性抗体用于PRRSV和PCV-2的防控提供了参考。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪园环病毒2型Cap蛋白 卵黄免疫球蛋白 保育猪
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猪圆环病毒1型和2型衣壳蛋白的表达与鉴定 被引量:2
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作者 成大荣 朱善元 +2 位作者 陈长春 金山 徐建生 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期760-764,共5页
根据已经发表的猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(Cap)分别设计一对引物,利用PCR方法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST... 根据已经发表的猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(Cap)分别设计一对引物,利用PCR方法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pCAP-PCV1和pCAP-PCV2,并分别转化大肠杆菌BL21。序列测定表明,所克隆的序列大小均为579bp,其中PCV1的cap基因与GenBank中的U49186序列一致,PCV2的cap基因与DQ104422序列一致。通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证明携带重组质粒pCAP-PCV1或pCAP-PCV2的大肠杆菌均可以表达融合蛋白形式的衣壳蛋白(分别命名为GST-CAP1和GST-CAP2,分子量约为49ku)。通过免疫小鼠制备了GST-CAP1和GST-CAP2多价血清,并通过dot-ELISA进一步证明了PCV1与PCV2的抗原交叉性。猪圆环病毒衣壳蛋白的表达,将为临床检测PCV抗体提供诊断抗原以及为研制PCV单克隆抗体提供材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 pcv1 pcv2 衣壳蛋白 表达
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稳定表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白P815细胞系的建立 被引量:2
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作者 宋勤叶 杨汉春 +1 位作者 郭鑫 盖新娜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期646-648,662,共4页
应用脂质体介导的基因转染方法,将表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus,PCV2)衣壳蛋白的重组质粒pcDNA3.1-orf2转染P815细胞,筛选G418抗性单克隆细胞,并经PCR、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,随后对目的蛋白表达稳定性进行了检测。结果表... 应用脂质体介导的基因转染方法,将表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus,PCV2)衣壳蛋白的重组质粒pcDNA3.1-orf2转染P815细胞,筛选G418抗性单克隆细胞,并经PCR、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,随后对目的蛋白表达稳定性进行了检测。结果表明PCV2orf2基因已经整合进P815细胞基因组DNA中,ORF2编码的衣壳蛋白在获得的阳性P815细胞中稳定表达,建立了稳定表达PCV2衣壳蛋白的P815细胞系。该细胞系的建立为PCV2新型疫苗的研究提供了必要的实验材料,同时也可为其他病毒疫苗的研究提供有价值的参考。 展开更多
关键词 pcv2衣壳蛋白 P815细胞系 表达 CTL杀伤活性
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猪圆环病毒2型Cap蛋白间接ELISA诊断方法的建立和应用 被引量:2
8
作者 闫若潜 吴志明 +4 位作者 刘光辉 谢彩华 王东方 王英华 贾松涛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第5期53-57,共5页
以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型(PCV-2)重组结构蛋白(rCap蛋白)为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测... 以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型(PCV-2)重组结构蛋白(rCap蛋白)为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1%BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm<0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm>0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm<0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2 CAP蛋白 间接ELISA 检测 应用 试剂盒
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猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达
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作者 陈长春 周建强 +4 位作者 潘琪 蔡丙严 徐婷婷 王海燕 曹军平 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第35期20090-20092,共3页
[目的]检测猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白(Cap)的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因(Cap)设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的... [目的]检测猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白(Cap)的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因(Cap)设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达载体质粒pET28a(+)中,获得重组质粒pCAP-PCV2,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。[结果]序列测定表明,所克隆的序列大小为579 bp,与DQ104422的Cap基因序列一致;通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析证明,携带重组质粒pET-PCV2-Cap的大肠杆菌可以表达可溶性的衣壳蛋白。[结论]PCV2衣壳蛋白能通过表达载体质粒pET28a(+)进行可溶性表达。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 pcv2 衣壳蛋白 表达
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猪圆环病毒2型Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
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作者 魏艳秋 李丽敏 +4 位作者 孙泰然 宋勤叶 逯继成 李潭清 张义明 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第9期3-6,共4页
为了建立检测PCV-2抗体的间接ELISA方法,本研究以猪圆环病毒2型(PCV-2)重组Cap蛋白作为包被抗原,优化了反应条件及抗原、抗体工作浓度。结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1∶80;最佳封闭液和抗体稀释液为... 为了建立检测PCV-2抗体的间接ELISA方法,本研究以猪圆环病毒2型(PCV-2)重组Cap蛋白作为包被抗原,优化了反应条件及抗原、抗体工作浓度。结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1∶80;最佳封闭液和抗体稀释液为含1%明胶、0.05%Tween-20的0.01 mol/L p H值7.4 PBS;当被检血清的OD450nm值≥0.3时为阳性,当OD值〈0.3时为阴性。该方法与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、猪流行性腹泻等病毒抗体无交叉反应,与免疫过氧化物酶单层试验的符合率为98.3%,批内与批间重复性试验的变异系数分别低于5%与8%。应用建立的方法检测了126份2013年采集的猪血清,PCV-2抗体阳性率为40%~100%,表明河北省的猪群中PCV-2感染率很高。 展开更多
关键词 pcv-2 重组CAP蛋白 间接ELISA 抗体 应用
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表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定 被引量:6
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作者 钟罗华 邓舜洲 +4 位作者 胡杨 徐昌满 罗锋 张文波 陈松昌 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第2期279-290,共12页
为探索猪痘病毒(swinepox virus,SWPV)作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基... 为探索猪痘病毒(swinepox virus,SWPV)作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(pcv2) 衣壳蛋白 重组猪痘病毒
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利用EDA融合标签高效表达猪圆环病毒2型壳蛋白(英文) 被引量:1
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作者 郭婉莹 申欢欢 +1 位作者 刘起涛 郑悦亭 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期183-188,共6页
原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表... 原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表达量低等问题。因此,通过使用各种融合标签以增加目的重组蛋白的表达量和溶解性成为有效的方法。本研究通过使用3种融合标签(EDA标签、MBP标签和GST标签)以获得表达量高的可溶性重组表达猪圆环病毒2型壳蛋白;并比较3种融合标签对该蛋白表达量、溶解性和稳定性的影响。研究结果表明,EDA标签可以显著提高重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,并且能够增强该蛋白的稳定性;MBP标签可增强重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,但是不能改善该蛋白的稳定性;GST标签能够增强该重组表达蛋白的表达量,但是不能增强该蛋白的溶解性和稳定性。本研究将EDA作为PCV2-CP蛋白的融合标签,显著提高PCV2-CP-EDA重组蛋白的表达量和增强该重组蛋白的稳定性,为病毒蛋白的可溶性重组表达提供了一种新的融合标签。 展开更多
关键词 重组表达 融合标签 EDA 猪圆环病毒2型壳蛋白
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猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达
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作者 林优红 程霞英 +6 位作者 杨东风 姜永厚 邢少辰 韦正乙 韩蕊莲 梁宗锁 杨宗岐 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期350-356,共7页
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associate... 猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(pcv2) 可读框2(ORF2)基因 衣壳(Cap)蛋白 烟草叶绿体 基因枪转化
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猪圆环病毒2型REP蛋白的原核表达及免疫原性鉴定 被引量:2
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作者 徐萍 范娟 +3 位作者 叶正琴 魏荣荣 宋庆庆 丁国伟 《安徽农业科学》 CAS 2018年第28期84-87,共4页
[目的]开发和研制鉴别猪圆环病毒疫苗免疫和野毒感染的ELISA检测试剂盒。[方法]根据NCBI数据库录入的2型猪圆环病毒(porcine circovirus 2,PCV-2) REP蛋白序列(Gen Bank登录号为KX828581)设计引物,利用PCR扩增REP蛋白全长基,构建原核表... [目的]开发和研制鉴别猪圆环病毒疫苗免疫和野毒感染的ELISA检测试剂盒。[方法]根据NCBI数据库录入的2型猪圆环病毒(porcine circovirus 2,PCV-2) REP蛋白序列(Gen Bank登录号为KX828581)设计引物,利用PCR扩增REP蛋白全长基,构建原核表达载体p ET-28a-rep,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。[结果]经过SDS-PAGE分析,获得了大小约40 ku的目的蛋白,与理论大小相一致。重组蛋白经镍柱纯化后重组蛋白浓度为40μg/m L,纯度约95%。Western Blot及ELISA鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。[结论]鉴于该重组蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该重组蛋白可为开发区分猪圆环病毒2型疫苗免疫和野毒感染的检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 pcv-2 REP蛋白 原核表达 免疫原性
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PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的小鼠免疫试验 被引量:3
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作者 许信刚 张宽 +1 位作者 王志昇 童德文 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期53-59,共7页
为了研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病双价基因工程亚单位疫苗,利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-OR... 为了研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病双价基因工程亚单位疫苗,利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF3-ORF2,并对该重组病毒进行Western-blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验以及淋巴细胞增殖试验。结果显示,重组杆状病毒表达了重组GP3蛋白和Cap蛋白;该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP3蛋白和Cap蛋白,并且重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠产生了抗PRRSV和抗PCV-2的特异性抗体,免疫小鼠血清中抗PRRSV和抗PCV-2的中和抗体效价分别达到1∶9.6和1∶13.6。淋巴细胞增殖试验表明,该重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。结果表明,表面展示PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白的重组杆状病毒已构建成功,这为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和PCV-2的共感染奠定了基础。 展开更多
关键词 杆状病毒表面展示系统 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒2 GP3蛋白 CAP蛋白
原文传递
猪圆环病毒Ⅱ型rep蛋白的亚细胞定位生物信息学析 被引量:1
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作者 王印 李昕然 +1 位作者 姜雪梅 徐志文 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第4期1110-1113,共4页
从GenBank发表的PCV-2全基因组序列,随机选择其中的32个全基因序列,做序列比对和同源性比较,绘制系统进化树,在注释中找到ORF1编码的rep蛋白氨基酸序列,用在线生物信息学工具对其进行亚细胞定位分析。结果基本符合"来自同一地区的... 从GenBank发表的PCV-2全基因组序列,随机选择其中的32个全基因序列,做序列比对和同源性比较,绘制系统进化树,在注释中找到ORF1编码的rep蛋白氨基酸序列,用在线生物信息学工具对其进行亚细胞定位分析。结果基本符合"来自同一地区的基因序列同源性较高"的规律,表明了PCV的高度保守性,亚细胞定位分析发现其rep蛋白定位于核区的指数为0.76,这与病毒在宿主细胞核内复制分不开。结果同时表明其定位于过氧化物酶体的指数显著不同于其他(过氧化物酶体平均0.36,可变,溶酶体、线粒体均为0.1不变)这可能与pcv的组织嗜性以及复制靶细胞(多为单核/巨噬细胞)的原因相关。 展开更多
关键词 pcv-Ⅱ REP蛋白 生物信息学 亚细胞定位
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母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪感染PCV-3的影响 被引量:1
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作者 张黎 郑龙龙 +3 位作者 吕晓玲 白瑞 霍乃蕊 郑明学 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1109-1114,共6页
为了解猪圆环病毒3型病毒(porcine circovirus 3 virus, PCV-3)ORF2基因的分子生物学信息,探寻防控PCV-3损害仔猪的可行方案。本研究通过对山西省某未免疫过PCV-2商品疫苗的规模化母猪场的妊娠母猪在产前45 d持续6批次免疫PCV-2疫苗,以... 为了解猪圆环病毒3型病毒(porcine circovirus 3 virus, PCV-3)ORF2基因的分子生物学信息,探寻防控PCV-3损害仔猪的可行方案。本研究通过对山西省某未免疫过PCV-2商品疫苗的规模化母猪场的妊娠母猪在产前45 d持续6批次免疫PCV-2疫苗,以所生仔猪生产成绩和PCV-3 ORF2基因阳性检出率为指标,评价母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪PCV-3的感染和发病情况的缓解作用。临床数据显示母猪免疫PCV-2疫苗后生产的6批仔猪PCV-3 ORF2基因阳性率由45.0%逐渐降至20.0%,伤亡率由25.5%降至8.0%。试验结果显示,从死亡仔猪淋巴结分离出的6株PCV-3 ORF2基因序列同源性为98.4%~99.2%,均有17个磷酸化位点,预测Cap蛋白氨基酸N端不存在典型的信号肽结构,说明该蛋白位于胞外区的可能性更大,且未预测到跨膜结构存在;PCV-3 ORF2与PCV-2a同源性为32.5%~32.9%,与PCV-2b同源性为30.8%~31.7%,与PCV-2d同源性为32.6%~33.5%,与PCV-4同源性为33.9%~34.3%,说明同源性低,进化不同步。因此,推测母猪通过持续的免疫PCV-2疫苗可解除PCV-2感染造成的机体免疫抑制,增强自身健康情况,降低PCV-3传播给仔猪的风险,用于控制仔猪群PCV-3流行是可行的应急方式。 展开更多
关键词 pcv-2疫苗 pcv-3感染 ORF2基因 CAP蛋白
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猪圆环病毒2型Rep蛋白基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量:4
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作者 李文良 毛立 +4 位作者 张纹纹 王小敏 茅爱华 甘源 江杰元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1154-1158,共5页
采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的... 采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的抗原性。利用纯化的重组蛋白rRep作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。抗原最适包被质量浓度为1mg/L(0.1μg/孔),待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000。用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清,结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为<5%和<10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用rRep-ELISA对113份血清样品进行检测,与rCap-ELISA结果比较,rRep-ELISA检测阳性率为50.44%(57/113),略低于后者的54.87%(62/113),2种方法检测符合率为88.5%(100/113),具有较好的一致性。这为PCV-2感染的流行病学调查和新型ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。 展开更多
关键词 pcv-2 REP蛋白 原核表达 ELISA
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N-末端核定位序列对猪圆环病毒衣壳蛋白病毒样颗粒在汉逊酵母中组装的影响 被引量:1
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作者 张高峡 傅文彬 +1 位作者 胡薇 沈琼 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第10期1037-1042,共6页
目的探讨N-末端核定位序列(nuclear localization signal,NLS)对猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)中组装的影响。方法分别构建表达PCV2 ... 目的探讨N-末端核定位序列(nuclear localization signal,NLS)对猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)中组装的影响。方法分别构建表达PCV2 ORF2全长及NLS截短型重组表达质粒p MOXZ-full和p MOXZ-ΔN40,电转至HP,构建重组酵母表达菌株full-HP和ΔN40-HP,获得的两种表达产物经蔗糖密度梯度超速离心及超滤后,Western blot法检测两种表达产物的单体蛋白表达和VLP组装效率,透射电子显微镜观察VLP形态,小鼠免疫试验检测VLP的免疫原性,地高辛标记DNA杂交法检测VLP的DNA结合能力。结果与全长ORF2表达产物PCV2-VLP(full)比较,NLS截短型表达产物PCV2-VLP(ΔN40)的单体表达量略有提高,但VLP组装效率及DNA结合能力均降低。两种VLP颗粒形态相近,直径约20 nm;两种VLP免疫小鼠血清的抗体几何平均滴度(GMT)差异无统计学意义(P>0.05)。结论去除NLS可提高PCV2衣壳蛋白VLP单体的表达水平,但不是VLP组装所必须的,且可使VLP的组装率略有降低。本研究为PCV2-VLP结构和疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 核定位序列 猪圆环病毒2 衣壳蛋白 病毒样颗粒 汉逊酵母
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