miR-21靶向调控PDCD4在四逆汤减轻大鼠心肌细胞损伤中的意义

目的探讨四逆汤含药血清在减轻大鼠心肌细胞损伤中,微小RNA-21(miR-21)靶向调控程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的意义。方法选择SD大鼠制备四逆汤含药血清,体外培养大鼠心肌细胞(H9C2),通过RNA干扰技术,转染miR-21 mimic及miR-21 inhibitor,建立稳定的miR-21 mimic和miR-21 inhibitor细胞系。细胞分别给予阿霉素(ADR)10μg/mL作用24 h损伤和无ADR处理,再各分为四个水平,分别为miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、四逆汤+miR-21mimic、四逆汤+miR-21 inhibitor,另设正常对照组及四逆汤组,共10组。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-21、PDCD4表达,采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡百分率。结果与正常对照组相比,ADR+miR-21 mimic组、ADR+miR-21 inhibitor组、ADR+四逆汤+miR-21 mimic组、ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞凋亡百分率、PDCD4表达量增加,而miR-21的表达量下降(P均<0.05或0.01);ADR+miR-21 mimic组相比,ADR+四逆汤+miR-21 mimic组miR-21表达上升,PDCD4下降,凋亡百分率降低(P均<0.05);与ADR+miR-21 inhibitor组相比,ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞miR-21表达上升,PDCD4下降,凋亡百分率降低(P均<0.05)。结论四逆汤可抑制阿霉素损伤大鼠心肌细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤,其机制可能与上调miR-21的表达靶向调控PDCD4有关。

PDCD4基因在过氧化氢诱导喉癌细胞凋亡中的作用

目的探讨过氧化氢诱导喉癌细胞Hep-2凋亡过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的喉癌细胞Hep-2为实验材料,不同浓度的过氧化氢作用于Hep-2细胞,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,采用吖啶橙染色、Ho33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western blot检测PDCD4 mRNA水平及蛋白表达的变化,评价在过氧化氢诱导喉癌细胞Hep-2凋亡过程中PDCD4基因的作用。结果过氧化氢(200μmol/L)作用Hep-2细胞24h,能够显著抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,同时引起pdcd4 mRNA水平显著上调,PDCD4蛋白表达显著增加。结论本研究首次报道PDCD4基因可能在氧化胁迫诱导喉癌细胞凋亡中起关键作用。

抑癌基因Pdcd4在肾透明细胞癌中的表达及生物学意义

目的研究Pdcd4 mRNA及蛋白在肾透明细胞癌中的表达及探讨其与肾肿瘤分期分级的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（半定量RT-PCR）及免疫组织化学方法同时检测肾脏透明细胞癌及癌旁正常组织Pdcd4 mRNA及蛋白的表达情况。结果 Pdcd4 mRNA在肾癌及癌旁正常组织中均有表达,透明细胞癌中的表达低于癌旁正常组织。肾透明细胞癌Pdcd4蛋白表达阳性率为37.5%（15/40）,显著低于癌旁正常肾脏组织阳性表达率90%（18/20）,G1~G2期Pdcd4蛋白表达阳性率为56.5%（13/23）高于G3~G4期Pdcd4蛋白表达阳性率为11.7%（2/17）,两者差异有显著性（P〈0.05）。结论 Pdcd4基因在肾透明细胞癌中呈低表达,与肾癌的发生及恶性分化程度相关,作为抑癌基因,Pdcd4蛋白表达可作为判定肾透明细胞癌生物学行为的客观指标。

新的抑癌基因PDCD4最新研究进展

目的:程序性细胞死亡4(PDCD4)是一种新的细胞凋亡相关基因,最近来自动物和人类肿瘤的研究显示 PDCD4可能是一种新的抑癌基因,在肿瘤的发生、发展中可能发挥重要作用。本文从该基因的发现、生物学特点以及与肿瘤发生、发展的关系进行了综述。

PDCD4基因在胶质瘤细胞系的稳定表达及其对肿瘤细胞生长的影响

目的:建立稳定表达程序性死亡4基因(programmed cell death4,PDCD4)的人神经胶质瘤U251细胞系,观察PDCD4基因对人神经胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响。方法:将构建好的携带PDCD4重组真核表达载体pEGFP-PDCD4转染U251细胞,经过G418筛选获得稳定细胞系;用RT-PCR及Western blotting检测PDCD4mRNA和蛋白的表达情况,通过锥虫蓝染色活细胞计数法及克隆形成实验检测外源PDCD4转染对细胞增殖和克隆形成能力的影响,以流式细胞术检测细胞周期。结果:成功建立稳定表达PDCD4的胶质瘤细胞U251-PDCD4。未转染的U251及空载体转染的U251细胞均不表达PDCD4,而pEGFP-PDCD4转染的U251-PDCD4细胞表达高水平的PDCD4mRNA和蛋白质;转染PDCD4基因的细胞生长速度明显减慢(P<0.01)、克隆形成率明显降低(P<0.01);细胞周期检测显示,转染PDCD4的细胞较其他两对照组细胞S期升高、G2/M期明显降低(P<0.05)。结论:PDCD4通过干扰细胞周期明显抑制胶质瘤U251细胞的细胞增殖及克隆形成能力。

过氧亚硝酸盐增强人脑血管平滑肌细胞PDCD4基因表达

目的探讨过氧亚硝酸盐(ONOO-)诱导人脑血管平滑肌细胞(HCVSMCs)凋亡过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的HCVSMCs系为实验材料,观察不同浓度的ONOO-对HCVSMCs的作用。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,吖啶橙染色、Ho33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western blot检测PDCD4的mRNA及蛋白表达。结果ONOO-作用HCVSMCs 24 h,显著抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,同时引起PDCD4mRNA及蛋白表达显著增加。结论PDCD4基因可能在ONOO-诱导HCVSMCs凋亡的信号传导通路中起到关键作用。

miRNA-21-5p通过pdcd4靶向调控胃癌细胞对顺铂敏感性的机制研究

目的:探究微小RNA-21-5p(miRNA-21-5p)通过下调pdcd4基因表达调控胃癌耐药细胞系SGC-7901/DDP对顺铂敏感性机制的研究。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度的顺铂(0、1、2、4、8、16、32μmol/L)对胃癌细胞系SGC7901及胃癌耐药细胞系SGC7901/DDP增殖抑制的影响。通过实时荧光定量PCR检测SGC7901/DDP细胞中瞬时转染miRNA-21-5p inhibitors后miRNA-21-5p相对表达量的变化。采用Western blot及实时荧光定量PCR检测转染组、无关序列转染组(NC组)及空白转染组(CON组)分别转染miRNA-21-5p inhibitors及无关序列后对靶基因pdcd4蛋白及mRNA表达量的影响。结果:MTT实验结果显示耐药细胞SGC7901/DDP相对于亲本细胞SGC7901对顺铂不敏感(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,转染组miRNA-21-5p表达量均明显低于NC组和CON组(P<0.01),转染组pdcd4 mRNA表达量均明显高于NC组和CON组(P<0.01)。Western blot检测结果示,转染组pdcd4蛋白表达量均明显高于NC组和CON组(P<0.01)。结论:miRNA-21-5p表达水平的升高在一定程度上有利于胃癌细胞增殖,并通过下调pdcd4的表达,降低胃癌细胞对顺铂的敏感性。

miR-200b调控PDCD4的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨miR-200b对乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响及其可能的分子机制。方法利用荧光实时定量PCR检测人乳腺癌组织及乳腺癌细胞株中miR-200b的表达差异;利用生物信息学方法预测miR-200b的靶基因,并使用免疫蛋白印迹实验对靶基因的表达进行验证;分别将miR-200b siRNA、PDCD4 mimics以及相应对照miRNA转染MCF-7细胞,通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果miR-200b在乳腺癌组织中呈低表达水平,进一步抑制miR-200b的表达,乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力显著增强(P<0.05);将miR-200b siRNA、PDCD43′-UTR共转染到乳腺癌MCF-7细胞中,双荧光素酶报告基因结果显示抑制miR-200b的表达后,PDCD4的表达及活性相应上调(P<0.05);同时通过蛋白免疫印迹实验可以发现,抑制miR-200b表达后,PDCD4蛋白表达含量降低,乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力明显增强(P<0.05);而过表达PDCD4后PDCD4蛋白表达含量增加(P<0.05),乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论miR-200b可靶向上调PDCD4基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力。

胶质瘤与PDCD4的研究进展

PDCD4(Programmed cell death 4)是近年来发现的与细胞凋亡相关的新的肿瘤抑制基因,研究发现PDCD4在多种肿瘤中存在缺失或下调,并影响肿瘤细胞的生物学行为。PDCD4是否是肿瘤细胞凋亡的关键因子?能否成为胶质瘤治疗的新的突破点?本文将围绕PDCD4最新研究进展,及其与胶质瘤的凋亡的相关性进行综述。

miR-421靶向PDCD4促进前列腺癌DU145细胞增殖的实验研究

目的研究MicroRNA-421(miR-421)促进前列腺癌DU145细胞增殖的作用及潜在的分子机制。方法培养前列腺癌DU145细胞,分为对照组、miR-阴性对照(NC)组、miR-421组、miR-421+pcDNA组、miR-421+pcDNA-细胞程序性死亡基因4(PDCD4),miR-NC组转染miR-NC、miR-421组转染miR-421、miR-421+pcDNA组转染miR-421及pcDNA质粒、miR-421+pcDNA-PDCD4组转染miR-421及pcDNA-PDCD4质粒,MTS法测定细胞增殖活力,荧光定量PCR测定PDCD4的mRNA表达水平,western blot测定PDCD4的蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-421与PDCD4的靶向结合。结果与对照组及miR-NC组比较,miR-421组的增殖活力增加,PDCD4的表达水平及野生型PDCD4双荧光素酶报告基因的荧光活力均降低(P<0.05);与miR-421+pcDNA组比较,miR-421+pcDNAPDCD4组的增殖活力降低,PDCD4的表达水平增加(P<0.05)。结论 miR-421对前列腺癌DU145细胞的增殖具有促进作用,靶向抑制PDCD4是miR-421发挥这一作用的潜在分子机制。

CRP基因沉默后心肌细胞系H9c2的miR-21及其靶基因表达、细胞活力观察

目的观察沉默炎症因子CRP基因对H9c2心肌细胞活力的影响,并探讨其机制。方法 (1)取H9c2心肌细胞,随机分为CRP沉默组和对照组。CRP沉默组转染对CRP特异性沉默的p LV-shRNA-CRP慢病毒,对照组转染无敲减作用的p LV-shRNA-Scramble慢病毒。筛选与鉴定慢病毒载体成功转染H9c2心肌细胞。转染48 h后,采用实时定量PCR法观察两组H9c2心肌细胞CRP基因的沉默效率、miR-21及PDCD4、PTEN、Spry1 mRNA。(2)取H9c2心肌细胞,随机分为空白组、对照组和CRP沉默组,空白组不转染病毒加入等量的DMEM培养基,对照组转染p LV-shRNA-Scramble慢病毒颗粒,CRP沉默组转染p LV-shRNA-CRP慢病毒颗粒。转染24 h后,采用MTT法检测三组H9c2心肌细胞活力。结果 (1)CRP沉默组和对照组H9c2心肌细胞中CRP mRNA相对表达量分别为0. 320±0. 069、1±0. 090,miR-21相对表达量分别为0. 740±0. 099、0. 280±0. 010,两组相比P均<0. 01。CRP沉默组PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达均低于对照组(P均<0. 01)。(2)CRP沉默组、对照组和空白组细胞活力分别为0. 78±0. 030、0. 66±0. 010、1. 00±0. 013;与空白组相比,CRP沉默组和对照组细胞活力均下降(P均<0. 01);与对照组相比,CRP沉默组细胞活力上升(P <0. 05)。结论沉默CRP基因可促进H9c2心肌细胞存活,这可能与其可增加H9c2心肌细胞中miR-21表达,抑制PDCD4、PTEN和Spry1的基因表达有关。

miR-340-5p及PDCD4在过表达乙肝病毒X蛋白的足细胞中的表达及生物学意义

乙肝病毒X蛋白(HBx)引起足细胞损伤与乙型肝炎相关性肾小球肾炎的发病有关,但具体的机制尚不清楚。miR‐340‐5p是受到HBx调控的miR,能够靶向细胞程序性死亡基因4(PDCD4)基因发挥神经元保护作用。本研究观察了过表达HBx的足细胞中miR‐340‐5p及PDCD4表达的变化及生物学意义。培养小鼠足细胞系MPC5后转染HBx质粒、miR‐340‐5p、si‐PDCD4,MTS法检测细胞增殖活力OD490、TUNEL法检测细胞凋亡率、荧光定量PCR检测miR‐340‐5p的表达、Western blot检测PDCD4的表达、双荧光素酶报告基因实验验证miR‐340‐5p靶向PDCD4基因3’UTR。结果显示,与对照组比较,HBx组细胞中miR‐340‐5p的表达、OD490水平降低,PDCD4的表达、凋亡率增加;与HBx组比较,HBx+miR‐340‐5p组细胞中miR‐340‐5p的表达、OD490水平增加,PDCD4的表达、凋亡率降低,HBx+si‐PDCD4组细胞中OD490水平增加,PDCD4的表达、凋亡率降低,miR‐340‐5p的表达无明显改变;PDCD4基因3’UTR中有miR‐340‐5p的结合位点,miR‐340‐5p降低PDCD4基因野生型3’UTR的荧光活力、不影响PDCD4基因突变型3’UTR的荧光活力。以上结果表明,过表达HBx的足细胞中miR‐340‐5p表达减少,进而可能通过增加PDCD4的表达引起足细胞损伤。本研究创新点为探究了HBx引起足细胞损伤的分子机制,国内首次发现miR‐340‐5p靶向PDCD4在HBx引起足细胞损伤中的作用,为今后研究HBV‐GN的发病机制提供了参考。

RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。方法设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。结果与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。结论成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。

Peroxynitrite诱导下咽癌细胞凋亡与PDCD4基因活性相关性研究

目的探讨peroxynitrite(ONOO-)作用于下咽癌细胞过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的下咽癌FaDu细胞系为实验材料,不同浓度的ONOO-作用于FaDu细胞,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,采用Ho.33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western-blot检测PDCD4mRNA水平及蛋白表达的变化,评价PDCD4基因在ONOO-诱导FaDu细胞凋亡过程中的作用。结果 ONOO-(50、100、200μmol/L)作用FaDu细胞24h,能够显著抑制细胞增值,并诱导细胞程序性凋亡,同时引起PDCD4mRNA水平显著上调,PDCD4蛋白表达显著增加。结论 PDCD4基因可能在ONOO-诱导下咽癌细胞生长的信号转导调节通路中起到关键作用。

PDCD4转染卵巢癌细胞系基因表达谱的变化

目的探讨卵巢癌细胞系SKOV3稳定表达程序性细胞死亡4(PDCD4)基因后基因表达谱的变化。方法将pDsRed2-N1-PDCD4真核表达载体和pDsRed2-N1空载体分别转染至SKOV3并获得稳定细胞系,应用基因芯片技术分析PDCD4基因转染后基因表达的变化,RT-PCR检测基因的表达以验证芯片结果。结果PDCD4转染SKOV3后引起大量基因表达的变化,表达明显差异基因共有467个,其中上调255个,下调212个;RT-PCR验证选取的5个基因的表达差异和芯片显示的结果一致。结论成功筛选出PDCD4基因转染卵巢癌细胞系SKOV3后的差异表达基因,为进一步研究PDCD4的抑癌作用机制提供了实验依据。

PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响

目的探讨PDCD4基因对小鼠T淋巴细胞亚群分化的影响。方法采用流式细胞术检测PDCD4基因缺失小鼠脾细胞和淋巴结细胞中的CD8+T和CD4+T,及其亚群Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)的特异性标记分子,并分析各细胞亚群的比例变化。结果 pdcd4-/-小鼠脾脏和淋巴结中CD8+T细胞数量较野生型C57BL/6小鼠有所下降(P<0.05),CD4+T细胞及Th1细胞也呈下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05);而PDCD4基因缺失后Th2和Th17的分化比例无显著变化(P>0.05);进一步分析CD4+T细胞群体中CD25+Foxp3+Treg的表达,发现pdcd4-/-小鼠CD25+Foxp3+Treg比例明显上调(P<0.05)。结论 PDCD4基因能够影响部分T淋巴细胞亚群的分化,PDCD4基因敲除小鼠中CD8+T细胞数量下降和CD25+Foxp3+Treg比例升高,提示PDCD4基因有可能在免疫调节方面起到一定作用。而PDCD4基因对于CD4+T以及Th1、Th2和Th17的分化并无明显作用。

程序性细胞死亡基因PDCD4的系统发育分析

程序性细胞死亡-4 (programmed cell death 4, PDCD4)基因是抑癌基因,在多种人肿瘤组织细胞中低表达甚至表达缺失,在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用(孙玮等, 2007)。对从NCBI上下载的包括人、黑猩猩、大猩猩等12种哺乳类物种的序列进行分析,引用Blast+、MCScanX (Wang et al., 2012)、Colinearscan等生物信息学工具对核苷酸序列进行同源性共线性分析。用CLUSTALX (Thompson et al., 1997)软件进行多序列比对,基于最大似然法(ML)、最大简约法(MP)和邻接法(NJ)算法,使用系统发育分析软件MEGA7.0软件构建PDCD4基因的系统发育树,3种建树算法得到的拓扑结构基本一致。系统发育树表明:人、黑猩猩、大猩猩、苏门答腊猩猩和白颊长臂猿聚在一支,亲缘关系较近;家鼠、大白鼠、野猪和狗聚为一支;狒狒、猕猴和狨猴聚为一支。PDCD4基因的系统发育树与基于化石证据的物种树的一致,说明该基因的进化是伴随物种分歧一同发生的,是个相对古老的基因,有助于解决动物起源的相关信息和动物物种分化的相关问题。

miR-21介导的结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药机制研究

目的通过检测microRNA-21（miR-21）及其靶基因程序性细胞死亡因子4（programmedcelldeath4，PDCj）4）基因在结肠癌细胞中对下游通路的调控，研究高表达的miR-21在结肠癌细胞中对5-氟尿嘧啶（5-fuorouracil，5-FU）耐药的可能机制。方法MTT法检测5-FU处理后miR-21敲除或PDCD4高表达对RKO细胞存活率的影响；流式细胞术检测5-FU处理后RKO-敲除型与RKO-野生型细胞凋亡；定量PCR检测miR-21敲除后以及PDCD4高表达后RKO细胞中ABCC5及CD44mRNA水平的变化。结果5-FU对RKO-野生型的半抑制浓度（IC50）值（52．28±0．05）μmol／L比RKO-敲除型的ICso值（32．13±0．05）μmol／L高67％，同时miR-21敲除后细胞凋亡率显著增加；PDCD4在RKO-敲除型细胞中显著高表达，并且高表达的PDCD4能够负调控转运蛋白ABCC5及干细胞表面标记CD44。结论miR-21很可能通过抑制靶基因PDCD4调控转运蛋白ABCC5及干细胞表面标记CD44的表达，从而增强RKO细胞对5-FU的耐药性。