PDE5基因多态性对伐地那非治疗男性勃起功能障碍疗效的影响

目的伐地那非是临床治疗男性勃起功能障碍(ED)的一线药物,但疗效在不同人群中差异较大。本研究旨在探讨ED患者PDE5基因第2外显子Val 93 Ala基因多态性对伐地那非疗效的影响。方法对本院270例ED患者给予伐地那非口服1周,同时采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对所有患者进行PDE5基因分型,观察不同基因型治疗前后性功能指标变化、疗效及不良反应。结果270例ED患者中AA型为201例,AG型为44例,GG型为25例,基因型分布符合H-W平衡,具有群体代表性。伐地那非治疗后性生活持续时间、性生活满意度和IIEF评分各项指标在3种基因型之间差异有统计学意义,G等位基因携带患者有效率显著低于A等位基因携带患者。结论伐地那非治疗ED的疗效和个体遗传因素有关,PDE5基因G等位基因携带者疗效较差,应引起临床重视。

腺病毒载体介导PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响

目的:观察腺病毒载体介导的PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响,探讨利用RNAi技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性。方法:利用构建的携带2条靶向PDE5 mRNA靶位点的shRNAs重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组,于转染后24、48、72 h用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态检测细胞内钙离子荧光强度,以平均荧光指数(FI)反映细胞内游离钙的相对水平。结果:实验组在转染PDE5-shRNAs重组腺病毒24、48、72 h后钙离子荧光指数分别为829.3±7.8、801.5±9.5、856.3±8.7,均明显低于阴性对照组的1106.3±10.8、1121.3±10.2、1058.5±12.1和空白对照组的1076.6±9.7、1133.4±11.2、1104.3±10.5,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腺病毒介导的靶向PDE5基因的shRNAs能够明显降低大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙水平。

PDE5基因沉默对肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨PDE5基因对肾透明细胞癌细胞株786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法设计、合成PDE5 si RNA序列,按照Hi Per Fect转染试剂盒操作手册转染786-O细胞。采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)和Western blot法检测转染后PDE5基因的表达,通过WST-1法检测细胞增殖情况,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性。结果与空白对照组和阴性对照组相比较,PDE5 si RNA转染组的m RNA及蛋白表达水平显著降低,786-O细胞增殖能力明显受到抑制,caspase-3活性明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 si RNA干扰PDE5基因表达可抑制肾透明细胞癌细胞株786-O细胞的增殖并促进凋亡。

siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶表达的抑制作用

目的观察小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶(PDE5)表达的抑制作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法使用美国Ambion公司提供的设计软件设计人PDE5基因的siRNA序列,并合成3对PDE5siRNA和1对阴性对照siR-NA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。RT-PCR法半定量检测siRNA对PDE5mRNA表达的抑制作用;Westernblot法检测海绵体平滑肌细胞PDE5蛋白表达水平。结果siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5mRNA表达分别下降58.2%、14.9%和11.9%;PDE5蛋白表达量下降约70.5%、19.8%和17.3%;阴性对照siRNA组未引起PDE5mRNA和蛋白表达的变化。结论体外化学合成的PDE5siRNA能特异有效地下调PDE5基因表达,不同序列特异性的siRNA下调PDE5基因表达的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路。

PDE_5基因特异性siRNA改善糖尿病性勃起功能障碍大鼠勃起功能的研究

目的探讨大鼠PDE_5基因siRNA对糖尿病性勃起功能障碍(DMED)大鼠PDE_5基因表达的抑制作用及其对DMED大鼠勃起功能的影响。方法构建可同时表达2条针对大鼠PDE_5基因的shRNA重组腺病毒; 50只雄性SD大鼠随机取10只作为正常对照。其余建立DM ED大鼠模型,随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组,分别将重组腺病毒rAd-rPDE_5-shRNA、腺病毒rAd-mock及生理盐水注射于阴茎海绵体。注射后第7天,电刺激盆神经测定各组大鼠阴茎海绵体内压(ICP)及平均周围动脉压(MAP),然后取海绵体组织通过RT-PCR和Westem blot分别检测PDE_5基因mRNA及蛋白的表达。结果ICP/MAP实验组和正常对照组显著高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),实验组和正常对照组间无显著性差异(P>0.05);RT-PCR和Western blot分析,实验组大鼠PDE_5基因mRNA和蛋白表达均显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论PDE_5基因shRNA重组腺病毒转染可以改善DMED大鼠的勃起功能,为DMED治疗方法的探索提供了新的思路。

TF通过影响肝脏生物钟基因表达促进昼夜节律相位前移

目的研究磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂TF对小鼠昼夜节律相位前移的影响并探讨其对小鼠肝脏生物钟的作用机制。方法(1)跑轮实验:15只小鼠随机分为3组:对照组、西地那非(sildenafil)组和TF组。在小鼠原有节律的基础上将开灯时间提前8 h。改变光照当天ZT18时灌胃给药(30 mg/kg),记录小鼠的昼夜活动相移情况。(2)分子生物学实验:16只小鼠随机分为4组:对照组、西地那非组(30 mg/kg)、TF低剂量组(30 mg/kg)和TF高剂量组(60 mg/kg)。同跑轮实验条件,给药1 h后取小鼠肝脏,实时定量PCR法检测小鼠肝组织生物钟基因mRNA表达水平的变化,并对生物钟基因的蛋白表达产物进行免疫印迹分析。结果动物跑轮实验结果表明,在光照时间提前8 h后,与对照组相比[(9.400±0.548)d],西地那非组小鼠需(7.400±1.517)d、TF组小鼠需(7.200±1.304)d同步化到新的昼夜节律周期,两组均与对照组有显著性差异。在基因水平,与对照组相比,西地那非组和TF组肝组织bmal1、naps2的mRNA表达水平均呈现显著上调,西地那非组和TF组(60 mg/kg)clock的mRNA表达水平呈现显著上调,西地那非组和TF组(30 mg/kg)rorα的mRNA表达水平呈现显著上调,per2和rev-erbαmRNA表达水平均显著下调,而per1、cry1、cry2、dec1的mRNA表达水平无显著变化。与对照组相比,西地那非组和TF组肝组织BMAL1、CLOCK蛋白表达水平显著上调,TF组RORα蛋白表达水平显著上调,西地那非组和TF组(60 mg/kg)NPAS2蛋白表达水平显著上调,西地那非组和TF组PER2、REV-ERBα的蛋白表达水平显著下调。结论TF能促进小鼠昼夜节律相位前移,并可同时在转录和翻译水平改变小鼠肝脏多种核心生物钟基因的表达。