Pdr1蛋白N端携带Flag标签的光滑假丝酵母的构建

近年来,光滑假丝酵母已成为第二位引起侵袭性真菌感染的病原体。光滑假丝酵母对唑类药物(临床一线抗真菌药物)的敏感性低且易发生耐药,一直是研究的热点。介导光滑假丝酵母对唑类药物耐药的关键基因是转录因子pdr1,其功能性突变会使Pdr1蛋白功能过度活跃,导致下游唑类药物外排泵基因高表达,从而对唑类药物耐药。本研究利用同源重组技术,构建在基因pdr1的5′端定点插入3×Flag标签的重组菌株2a2和2b2,为后续利用免疫染色质共沉淀技术寻找Pdr1直接调控基因奠定基础。结果表明,3×Flag标签添加到Pdr1蛋白N端可成功表达Flag-Pdr1蛋白;与野生型菌株相比,表达Flag-Pdr1的菌株对氟康唑的耐药性增强。此外,与野生型菌株相比,表达Flag-Pdr1的菌株中cdr1和pup1基因表达水平显著上升,提示在Pdr1蛋白N端加Flag标签能使其功能活跃,表明N端对Pdr1蛋白功能具有重要意义。

PDR1基因P927S突变调节光滑念珠菌对唑类药物耐药的机制

目的 了解PDR1基因调节光滑念珠菌对唑类药物耐药的机制.方法 收集5家医院的38株光滑念珠菌,采用微量稀释法检测氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑对光滑念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）.实时荧光定量PCR扩增PDR1基因并测序,构建含PDR1突变位点的表达质粒,转化入光滑念珠菌,罗丹明6G外排实验、CDR1和CDR2基因表达水平和药物敏感试验验证突变位点的功能.结果 38株光滑念珠菌中,有17株至少对一种唑类药物耐药,且每株耐药株的PDR1基因均存在突变.表型实验证实,P927S使光滑念珠菌CDR1和CDR2基因表达分别上调20.53倍和4.03倍,外排后罗丹明6G的荧光强度下降至0.62.结论 PDR1基因P927S突变可诱导光滑念珠菌CDR1和CDR2的表达,使外排泵的作用增强,从而导致菌株耐药.

光滑假丝酵母PDR1基因敲除菌株的建立

目的:构建光滑假丝酵母ATCC2001菌株PDR1基因敲除突变株。方法:用PRODIGE同源重组技术,以pY24GAL10为模板,设计80 bp长引物合成PDR1-URA3基因敲除组件,并将其转化入URA3已发生突变的ATCC2001/ura3菌株,经SD-URA选择性平板筛选后获得稳定敲除PDR1的ATCC2001/ura3 pdr1Δ菌株。结果:成功构建光滑假丝酵母PDR1基因敲除菌株ATCC2001/ura3 pdr1Δ。结论:此法可用于精确敲除光滑假丝酵母目标基因。ATCC2001/ura3 pdr1Δ菌株的构建将为进一步研究该基因在光滑假丝酵母中的功能及其作用机制奠定基础。

酿酒酵母锌簇转录因子Pdr1和Pdr3的研究进展

Pdrl(pleiotropic drug-resistant 1)和Pdr3是酿酒酵母中锌簇转录因子,具有调控多种多药耐药转运蛋白的作用。它们主要以二聚体的形式与靶基因的PDREs(Pdrlp/Pdr3p response elements,PDREs)区域结合,对多药耐药靶基因进行调控,从而引起酿酒酵母对环己亚胺、寡霉素等药物的耐药现象。Pdr3的表达调控还受到线粒体基因组的影响。

新疆某医院侵袭性念珠菌感染的菌种分布、药物敏感性及耐药基因初步分析

目的了解新疆某医院侵袭性念珠菌感染的菌株分布、药敏特征,探讨菌株对唑类抗真菌药的耐药机制。方法对分离自临床诊断深部真菌病患者的125株菌行形态学和分子生物学鉴定,分析念珠菌菌种分布特点、对9种抗真菌药的体外敏感性以及对唑类药物耐药菌株行ERG11和PDR1基因测序分析。结果鉴定成功的111株酵母菌株中,分离率在前三位的菌种次为白念珠菌(50.45%)、光滑念珠菌(18.02%)和热带念珠菌(15.32%)。药敏结果显示多数菌株对两性霉素B、5-氟胞嘧啶和棘白菌素类药物敏感,2株光滑念珠菌菌株对棘白菌素类药物耐药。白念珠菌对唑类药物体外敏感性较好,泊沙康唑和伏立康唑对光滑念珠菌和热带念珠菌的体外抑菌活性较低(<60%)。33株唑类耐药念珠菌(6株白念珠菌、14株光滑念珠菌、11株热带念珠菌、1株克柔念珠菌和1株近平滑念珠菌)中有9株存在ERG11基因错义突变,所有唑类耐药光滑念珠菌均存在PDR1基因错义突变。结论侵袭性念珠菌感染的主要致病菌为白念珠菌;棘白菌素类、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对念珠菌整体的体外抑菌活性较好,唑类药物对光滑念珠菌和热带念珠菌的抑菌活性较低;念珠菌ERG11和PDR1基因突变可能与唑类耐药相关。

促生细菌挥发性有机物调控根部质膜H^+-ATPase活性提高植物耐碱胁迫能力

根际促生细菌的挥发性有机化合物(VOCs)可以促进植物生长并提高植物对盐、旱和病菌的抵抗力。分析了芽孢杆菌PDR1产生的VOCs对拟南芥耐碱胁迫能力的影响及其生理机制。在芽孢杆菌PDR1存在或不存在的条件下,对拟南芥进行培养;检测对照和碱胁迫条件下拟南芥根部的各种离子含量;用pH指示剂(溴甲酚紫)和pH计检测拟南芥的根际酸化能力;检测拟南芥根部质膜H^+-ATPase活性。结果显示,芽孢杆菌PDR1的VOCs改善了同一空间中碱胁迫下拟南芥的根长和根部离子平衡;来自芽孢杆菌PDR1的VOCs增强了拟南芥根中质膜H^+-ATPase的活性,并提高了拟南芥植物的根际酸化能力。研究结果将促进对芽孢杆菌调节拟南芥生长和抗逆性机制的理解,并为其在农业生产和生态保护中的广泛应用奠定基础。

临床分离光滑假丝酵母菌唑类药物耐药机制研究

目的了解光滑假丝酵母菌临床分离株中唑类耐药株的耐药机制。方法收集2009年和2010年5家医院28例患者的38株光滑假丝酵母菌,根据CLSI M27-A3指南采用微量肉汤稀释法测定5种常用抗真菌药物(两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑)的最小抑菌浓度。采用Real-Time PCR法检测CDR1、CDR2及SNQ2等外排泵基因以及ERG11和转录因子PDR1的表达;流式细胞仪分析罗丹明6G外排能力,考察细胞膜外排泵功能;同时,PCR扩增ERG11基因全长以及PDR1基因主要功能区并测序比对。结果 38株光滑假丝酵母菌对两性霉素B和5-氟胞嘧啶均敏感,其中17株为唑类耐药菌。唑类耐药株CDR1基因表达明显高于敏感株(P=0.001),并且对罗丹明6G外排能力也显著强于敏感菌(P=0.001)。光滑假丝酵母菌敏感和耐药菌株ERG11表达差异无统计学意义(P=0.283),且ERG11基因未发现突变。此外,17株光滑耐药菌株PDR1基因表达量与敏感菌株比较差异无统计学意义(P=0.086),但每株耐药菌株PDR1基因均分别发现1处有义突变。结论转录因子PDR1突变、外排泵基因CDR1表达上调以及外排泵功能增强是目前临床上光滑假丝酵母菌唑类药物耐药的主要机制。