MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

肾包膜下异种移植技术在PDX模型中的应用进展

临床前模型往往不能捕捉人类恶性肿瘤的不同异质性,因此缺乏临床预测能力。患者来源的肿瘤异种移植(PDX)已经成为一种强大的技术:能够保留其原始样本的分子异质性。其中,肾包膜下异种移植技术是一种在动物体内建立人类癌症模型的方法,近年来受到越来越多的关注。基于这种技术,医学研究人员可以通过将从患者体内取得的原发肿瘤移植到小鼠肾包膜下,再通过小鼠体内长期的繁殖和观察,来研究癌症的生物学特性、组织学特征和治疗反应等。此篇综述了近年来该技术在临床和基础医学研究中的进展和应用,展现了其在肿瘤治疗和研究领域中的优势,为临床和基础研究人员在肿瘤防治研究方面提供参考。

肺癌恶性胸腔积液来源肿瘤细胞的小鼠PDX模型构建及实验验证

目的·构建肺癌患者恶性胸腔积液(malignant pleural effusion,MPE)肿瘤细胞来源的肿瘤异种移植(patientderived tumor xenograft,PDX)模型,并进行实验验证。方法·从基因表达综合数据集(Gene Expression Omnibus,GEO)下载人肺癌伴MPE单细胞转录组测序公共数据GSE131907和人肺癌实体瘤单细胞转录组测序公共数据GSE203360,对数据进行聚类、差异基因本体功能富集分析,明确应用MPE建模的可行性。同时收集肺癌患者的MPE样本,经离心、裂解红细胞等富集细胞操作后,将其植入非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠皮下,待移植瘤生长至1000 mm³时进行瘤体传代及保存。对稳定传代移植瘤进行组织病理学检测,通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)观察细胞组织形态,免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测肺癌标志物表达情况。结果·经单细胞数据分析发现MPE中肿瘤细胞的增殖功能更强,提示MPE中肿瘤细胞PDX建模或具备更佳成瘤效果;共收集35例肺癌MPE样本,成功构建13例PDX模型,成功率达37.14%;在组织病理学检测中,H-E染色可见移植瘤组织细胞异型性明显,IHC检测显示细胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)、甲状腺转录因子1(thyroid transcription factor-1,TTF1)和天冬氨酸蛋白酶A(Napsin A)等肺癌标志物均呈阳性表达。结论·通过富集肺癌患者MPE中的肿瘤细胞,成功构建了更为简便高效、可实时动态建模的PDX模型。该模型保留了肺癌患者肿瘤细胞的恶性特征及蛋白表达特性,为肺癌伴MPE患者的基础研究和临床用药指导提供了重要的实验模型工具。

PDX模型在肿瘤医学中的应用进展

癌症威胁着全球人类的生命和健康,其发病率和死亡率仅次于心血管疾病,一直是人们关注的焦点。良好的动物模型不仅可用于研究癌症的发生发展和生物学机制,还可用于抗癌药物的筛选和基因治疗。近年来,患者来源的异种移植(patient-derived xenograft, PDX)模型因其能够保留原发肿瘤的微环境和组织学特性而成为研究热点。对PDX动物模型的建模方法以及在肿瘤医学中的应用进行归纳总结,并分析其局限性,以期为PDX模型在肿瘤治疗领域中的应用提供重要参考。

PDX模型在肺癌靶向治疗中的应用进展

肺癌是最常见的肿瘤之一,也是全球癌症死亡的主要原因。近几十年来,肺癌治疗药物的研发及新的肺癌早期诊断生物标志物的开发都取得了重大进展,但传统的临床前模型即细胞系模型用于肺癌诊断和后期疗效评估仍有许多不足。目前,肺癌的临床前研究主要依赖患者来源的肿瘤异种移植(PDX)模型进行药物筛选、联合临床试验和个性化医疗策略的临床前评估。本文概述了PDX模型的建立及其特征,并讨论了其在肺癌临床前治疗中的应用。

天然产物调控PDX1抗糖尿病作用的研究进展

胰腺-十二指肠同源盒1基因(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX1)是决定胰腺分化和发育,调控胰岛素的关键基因。PDX1的缺失及下调可诱发糖尿病的发生和发展,而对其上调则能够调节胰腺发育、促β细胞分化和胰岛素分泌,发挥治疗糖尿病作用。PDX1已然成为糖尿病治疗药物开发的新靶点。越来越多的天然产物被发现具有上调PDX1的作用且表现出抗糖尿病活性。然而,目前尚未有相关文献进行总结报道。本文通过检索CNKI、Pubmed等数据库,对调控PDX1的天然产物抗糖尿病作用的相关研究进行归纳和总结,以期为靶向调控PDX1的新型抗糖尿病药物开发提供思路和参考。

完全性肺静脉异位引流潜在致病基因PDX1突变对其基因功能的影响

目的·采用全外显子测序技术筛查完全性肺静脉异位引流(total anomalous pulmonary venous connection,TAPVC)的可能致病基因,并对其功能进行验证。方法·选择2014—2019年在上海交通大学医学院附属新华医院及上海儿童医学中心确诊的100例TAPVC患儿(患儿组)以及120例健康儿童(对照组)为研究对象。收集2组儿童的血液样本,抽提全血基因组DNA并行外显子测序,以筛查TAPVC的潜在致病基因。通过Mutation Taster、SIFT、PolyPhen-2网站筛选致病基因的有害突变位点,并行Sanger测序。构建PDX1野生型(野生组)及突变型(突变组)质粒,转染入HUVEC细胞后,分别采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法检测突变对PDX1的mRNA和蛋白水平的影响。采用STRING数据库进行蛋白与蛋白之间的相互作用分析,并采用qPCR研究PDX1调节的下游基因的表达。结果·在TAPVC患儿中发现致病基因为PDX1, Sanger测序显示该基因存在2个新发突变,即c.C237A(P33T)和c.C237G(P33A)。与野生组相比,2个突变组(CA组、CG组)的PDX1 mRNA水平没有显著变化,但蛋白相对表达量有明显增加,即分别是野生组的2.9倍和3.4倍(P=0.000,P=0.001)。蛋白质相互作用分析的结果显示,PDX1与SOX17相关联;且qPCR结果显示,PDX1过表达可下调HUVEC细胞中SOX17的表达。结论·PDX1的2个新发错义突变可影响其转录后翻译,且PDX1可能是通过调控SOX17来参与TAPVC的发生与发展。

基于PRO/E及PDX的连续冲裁模设计方法

介绍了Pro/E软件中"连续模设计系统Progressive Die Extension(PDX)"在连续冲裁模设计中的应用。并结合实例说明了利用PDX设计连续冲裁模的过程。

PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】探讨PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用。【方法】将C2C12细胞分别经过不同浓度的类胰高血糖素(GLP-1)诱导120h后,瞬间转染胰腺十二指肠同源框(PDX-1)基因,用RT-PCR检测PDX-1的表达,流式细胞仪、放射免疫法检测细胞内和培养基中是否存在胰岛素。【结果】GLP-1可以直接诱导C2C12细胞表达PDX-1;PDX-1瞬时转染C2C12细胞后,胰岛素分泌细胞阳性率比值(1.19±0.10)、培养基中的胰岛素含量(2.45±1.48)×10-6U/mL均明显升高(P<0.05);单独的40nmol/LGLP-1诱导与瞬间转染PDX-1相比,阳性率比值及胰岛素浓度的差别均无统计学意义。【结论】GLP-1可以诱导C2C12表达PDX-1,而且PDX-1可以促进C2C12分泌胰岛素。提示GLP-1诱导C2C12分化为胰岛素分泌细胞可能与PDX-1有关。

启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化对胃癌中PDX1表达的影响

【目的】已知胃癌中PDX1表达下调,本研究旨在探讨DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰对PDX1基因表达的调控。【方法】免疫组化法检测胃癌组织芯片中PDX1、Dnmt1和HDAC的表达,分析其相关性。5’-aza-d C和TSA处理胃癌细胞,RT-PCR检测PDX1 m RNA水平,分析DNA去甲基化和组蛋白乙酰化对PDX1表达的影响;构建6个PDX1启动子片段至p GL3载体,检测转录活性,分析去甲基化和乙酰化对PDX1启动子转录活性的影响。MSP和BSP评估PDX1启动子DNA甲基化状态以及启动子活性受5’-aza-d C和Sss I的影响;Ch IP评估PDX1启动子组蛋白乙酰化状态以及启动子活性受TSA的影响。【结果】免疫组化结果显示与正常组织对比,胃癌组织中的PDX1表达下调,Dnmt1和HDAC表达上调,PDX1和Dnmt1及HDAC的表达负相关(P<0.05);5’-aza-d C和TSA使PDX1在胃癌细胞中重获表达;F383是PDX1启动子核心,5’-aza-d C和TSA增强F383转录活性,Sss I抑制F383转录活性;MSP结果显示F383在胃癌细胞中呈完全甲基化;BSP结果显示与对照比较,位于F383区域内17个Cp G位点中80%以上呈现甲基化。Ch IP分析结果提示F383呈组蛋白H3和H4低乙酰化。【结论】PDX1基因在胃癌中表达沉默与启动子DNA高甲基化和组蛋白低乙酰化有关。

Furin抑制剂α1-PDX对宫颈癌HeLa细胞生长、转移和成瘤的影响

目的研究α1-PDX对宫颈癌细胞株He La细胞生长、转移及成瘤的影响并探讨其机制。方法α1-PDX转染He La细胞,通过MTT细胞增殖实验,Boyden细胞迁移和侵袭实验观察He La细胞的生长,迁移和侵袭能力。采用蛋白印迹法检测细胞Furin及产物膜性Ⅰ型金属蛋白酶(MT1-MMP)蛋白量的变化,荧光酶底物实验检测Furin活性。制作He La细胞致瘤裸鼠模型研究肿瘤体内生长。结果细胞增殖实验结果显示,与对照组相比24 hα1-PDX组He La细胞体外生长抑制18.4%,差异有统计学意义(P<0.01);细胞迁移和侵袭实验结果显示,α1-PDX处理组穿过滤膜和基质胶的He La细胞数量均明显少于对照组(P<0.01);He La/PDX可显著降低Furin的活性和MTI-MMP的蛋白水平。He La/PDX致瘤裸鼠的成瘤机率及皮下肿瘤体积明显小于对照组。结论α1-PDX可有效抑制人宫颈癌He La细胞的生长、转移及成瘤能力,机制可能与降低Furin活性及产物MTI-MMP的表达有关。

妊娠期糖尿病患者胎盘PGC-1α和PDX1表达水平及甲基化状态与胎儿血糖水平的相关性

目的:探讨妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)对胎盘中PGC-1α和PDX1表达水平及甲基化状态的影响,以及与胎儿血糖的相关性。方法:收集30例GDM孕妇的新生儿出生体重、胎盘重量等数据,同时收集30例无妊娠并发症和脐带异常的足月新生儿相应数据作为对照组。在分娩后立即从胎盘滋养层组织收集样品,使用亚硫酸氢钠测序法定量检测PGC-1α和PDX1基因的DNA甲基化水平,逆转录定量PCR测量PGC-1α和PDX1 mRNA水平。同时,测定胎盘组织的胰岛素、血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)水平。结果:GDM组胎儿出生体重和胎盘重量均显著高于对照组(P <0.05)。GDM组胎盘组织胰岛素、HbA1c和血糖水平显著高于对照组(P <0.01)。脐带血胰岛素水平与新生儿出生体重、胎盘重量、血糖和HbA1c呈正相关(r值分别为0.648、0.795、0.862、0.927,P均<0.001)。与对照组比较,GDM组中PGC-1α和PDX1 mRNA的水平较低,PGC-1α基因甲基化水平较高(P <0.05)。胎盘组织中血糖水平与PGC-1α和PDX1 mRNA的表达呈负相关(r=-0.438,P=0.002;r=-0.373,P=0.007)。结论:GDM孕妇PGC-1α基因表观遗传修饰的变化可能是其后代糖代谢异常的原因之一。

重构腺相关病毒转导PDX-1对C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】重构含有PDX-1的腺相关病毒载体,将PDX-1转导入C2C12细胞,观察胰岛素分泌量的改变。【方法】应用PCR方法将PDX-1从pZL1质粒中克隆出来,安装到Stratagene公司的腺相关病毒(AAVHelper-FreeSystem)表达系统中,转染HEK293细胞,培养72h,提取病毒悬液,转导PDX-1进入C2C12细胞中,检测细胞培养液中的胰岛素含量。【结果】①用X-gal染色系统检测,可见有蓝色的阳性细胞。②病毒的粗略的浓度经计算后大约为1012/mL,转导的病毒数约为1011。③PCR结果:用重构的腺相关病毒转导后C2C12有胰岛素及PDX-1的mRNA的表达。④用重构的腺相关病毒转导PDX-1进入C2C12后的培养液的胰岛素浓度为(5.5±1.1)μIU/mL,较其他方法也有较明显的增加(P<0.05)。【结论】通过应用含有PDX-1基因的重构腺相关病毒载体可以转导PDX-1在C2C12细胞中表达,且可以提高C2C12分化为胰岛素分泌细胞的分泌量。

基于PDX模型的胃癌个体化治疗研究进展

胃癌是全球尤其是东亚地区高发恶性肿瘤之一,在中国60%的患者初诊时即为进展期且异质性强、传统治疗疗效低,故需要更精准的治疗方案。目前,缺乏快速有效的筛选与验证平台是肿瘤精准治疗的瓶颈。人源肿瘤异种移植瘤(patient derived tumor xenograft,PDX)模型已在多种类型的肿瘤中被证实是研究肿瘤生物学及评价抗肿瘤药物疗效的有效平台。本文将从三个层面对PDX模型在胃癌个体化治疗中研究进展进行综述,包括PDX在临床前药物疗效评估中的作用,PDX对生物标志物的鉴定及耐药机制研究,以及PDX在人-鼠联合临床试验中的作用。

胰腺十二指肠同源框基因PDX-1的体外扩增

目的提取大鼠胰岛细胞瘤细胞株的RNA,以其中的mRNA为模板,扩增胰腺十二指肠同源框-1(PancreaticDuodenalHomeobox-1)编码基因,并测定核苷酸序列,为进一步克隆及表达PDX-1cDNA奠定基础。方法采用TIZOL方法进行RNA提取;通过RT-PCR方法扩增大鼠PDX-1cRNA;琼脂糖凝胶电泳检测后进行序列测定。结果从大鼠胰岛细胞瘤细胞中提取了RNA,以其中的mRNA为模板扩增出大鼠PDX-1基因,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的片断,经序列测定与Genebank公布的序列一致。结论在国内首次成功的克隆了PDX-1基因。扩增时在5'端以限制性酶切位点进行限制,对进一步进行其克隆、表达研究以及对其生物学功能进行研究奠定了基础。

高浓度葡萄糖对PDX-1表达和胰岛素分泌功能的影响

目的探讨高浓度葡萄糖(Glu)对PDX-1表达的影响及其与胰岛素(Ins)分泌的关系。方法分别测定SD大鼠胰岛细胞基础和Glu刺激后Ins分泌量、细胞内Ins含量、细胞内PDX-1mRNA和蛋白的表达水平。结果1·高糖刺激3天后,基础和Glu刺激后Ins分泌量、细胞内Ins含量及PDX-1蛋白表达水平均明显降低(P<0·01)。2·在高糖环境下,延长培养时间可显著加强高糖对PDX-1蛋白表达的抑制作用。3·纠正高糖环境3天后可部分逆转高糖对PDX-1蛋白表达的抑制作用。结论高浓度Glu对PDX-1蛋白表达的抑制是Glu毒性作用的机制之一,纠正高糖3天后可部分逆转高糖对PDX-1蛋白表达的抑制作用,恢复Ins分泌功能。

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的:克隆小鼠pdx-1基因,构建其真核表达载体,并在小鼠胚胎干细胞中表达,为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法:PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组,将pdx-1基因cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点,形成重组载体pEGFP/pdx-1,转化大肠杆菌DH5α菌株,构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA,HindⅢ和BamHⅠ酶切,电泳,DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果:从小鼠胰腺cDNA扩增出876bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为pdx-1基因,插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13,24h后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论:小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。

PDX-1及其对胰岛β细胞的调控作用

胰腺十二指肠同源盒(PDX-1)具有促进胰岛β细胞增殖以及抑制其凋亡的作用。PDX-1通过调控胰岛素及胰岛素相关基因如葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖转运蛋白(GLUT2)等的表达,促进胰岛素分泌,维持胰岛β细胞的正常功能。提高胰岛β细胞PDX-1蛋白表达量,可对抗因“糖毒性”所致的胰岛β细胞功能损伤,促进胰岛素基因表达。PDX-1还可以将非胰岛素分泌细胞如肝细胞等转化为胰岛素分泌细胞。

氧化应激对2型糖尿病大鼠胰岛PDX-1表达的影响

目的:探讨氧化应激对2型糖尿病大鼠胰岛胰岛素的生物合成及分泌功能的影响。方法:检测正常Wistar大鼠及2型糖尿病大鼠血清的空腹血糖、餐后血糖及空腹胰岛素,并测定胰腺组织匀浆丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量;应用免疫组化法检测胰岛PDX-1、胰岛素的表达。结果:①糖尿病组大鼠胰腺匀浆MDA、NO含量升高,SOD、GSH-PX降低,胰岛PDX-1、胰岛素表达降低,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);②胰岛PDX-1的表达与MDA、NO呈负相关,与SOD、GSH-PX呈正相关(P<0.05)。结论:2型糖尿病大鼠胰腺存在氧化应激反应,可引起2型糖尿病大鼠胰岛PDX-1、胰岛素的表达下降,直接影响胰岛素的生物合成及分泌。

PDX通过P38 MAPK通路促进脓毒症性ARDS抗菌肽cathelicidin表达

目的:探究PDX对脓毒症性ARDS抗菌肽cathelicidin(CAMP)的影响及其具体机制。方法:C57BL/6小鼠行盲肠结扎穿孔术建立脓毒症模型,分为:假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、治疗组(CLP+PDX组)、抑制剂组(CLP+PDX+SB203580组)、溶剂对照组(CLP+PDX+DMSO组)、PDX组。采用HE染色观察肺组织损伤情况,进行肺损伤评分,菌落形成单位(CFU)检测细菌清除情况,qPCR检测肺组织CAMP基因表达情况,Westernblot检测肺组织CAMP蛋白表达以及P38MAPK、ERKMAPK通路激活情况。结果:与Sham组比,CLP组ERKMAPK通路无显著变化,P38MAPK通路受到抑制,CAMP表达显著升高(P<0.05);与CLP组相比,CLP+PDX组小鼠肺组织出血、炎性细胞浸润减轻,CFU显著降低,P38MAPK通路明显活化,且CLP+PDX组中CAMP表达进一步升高(P<0.05)。结论:PDX通过调控P38MAPK通路促进脓毒症性ARDSCAMP的表达。