靶向抗肿瘤GnRH-PE39KDEL融合蛋白表达培养基的优化

通过筛选培养基、单因子筛选试验及正交试验进行摇瓶发酵,确定适合该菌株表达融合蛋白的最佳培养基配方。采用该优化培养基可使抗肿瘤GnRH-PE39KDEL融合蛋白表达量占总蛋白的34.5%,占可溶蛋白的40%。

重组免疫毒素GnRH-PTD-PE39KDEL的构建及表达

通过引入蛋白质转导域(PTD),提高免疫毒素人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A衍生物(GnRH-PE39KDEL)对肿瘤细胞的杀伤活性。设计了3条引物,通过2轮PCR在GnRH-PE39KDEL基因的人促黄体激素释放激素C端和绿脓杆菌外毒素A衍生物N端引入PTD,获得GnRH-PTD-PE39KDEL基因经酶切后插入pET-His载体,并转化至BL21(DE3)中。采用镍离子螯合层析法纯化诱导表达样品,并进行了生物活性测定。成功构建了免疫毒素表达载体pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL;诱导产物可以实现可溶性表达;表达产物占菌体总蛋白的20%,靶向融合蛋白引入PTD后对人乳腺癌MCF-7细胞的IC50为0.860μg/mL,表明较GnRH-PE39KDEL生物活性增强。成功地表达了融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL,为其进一步大规模表达、纯化和功能研究奠定了基础。

重组血管内皮受体F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白抑制肿瘤生长的实验研究

检测融合表达的F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A(F3-PE39KDEL)在抗肿瘤细胞及活体肿瘤抑制方面的作用效果。用MTT法检测F3-PE39KDEL对肿瘤细胞株的抑制活性。小鼠半致死剂量LD50检测毒理学性质,裸鼠成瘤实验检测F3-PE39KDEL对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制。结果表明,融合蛋白F3-PE39KDEL能很好抑制肿瘤细胞和人结肠癌的生长,同时具有较低的生物学毒性。说明F3-PE39KDEL具有抑制人结肠癌生长的潜在应用价值。

重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物(GnRH-PE39KDEL)为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)及BL21(DE3)plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37℃培养至OD600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95%以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。

重组F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A抑制肿瘤生长

为检测重组的F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A(F3-PE39KDEL)的抗肿瘤作用,采用MTT法检测F3-PE39KDEL对人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人卵巢癌细胞SKOV3和人肝癌细胞HepG2的生长抑制活性。采用半数致死剂量法观察F3-PE39KDEL对小鼠的毒性反应。以接种人肺癌细胞的裸鼠为模型,观察F3-PE39KDEL的抗肿瘤作用。结果显示,培养72、120 h时,F3-PE39KDEL对于人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性,IC50分别为0.41、0.42μg/mL,4.95、2.53μg/mL。毒性试验结果显示,静脉注射给予F3-PE39KDEL后小鼠的半数致死量为1.1782 mg/kg,动物出现自发运动减少,死亡集中在给药后1 d内,死亡动物及实验结束存活动物剖检未见异常。F3-PE39KDEL对荷瘤裸鼠具有较强的抗肿瘤活性,剂量分别为0.1、0.2、0.4 mg/kg,其抑制率分别达到37.0%、43.2%、53.1%,显示出良好的量效关系。F3-PE39KDEL在靶向治疗肿瘤方面具有较好的应用前景。