空肠弯曲菌黏附蛋白(PEB1)基因工程疫苗外周神经安全性的实验研究

目的以空肠弯曲菌(campylobacterjejuni,CJ)菌体全抗原为对照,以基因重组的该菌融合黏附蛋白(TrxA/PEB1)作为CJ疫苗免疫大鼠,并对其神经安全性进行实验性评价。方法分别以纯化的TrxA/PEB1和CJPen19菌体全抗原经全身免疫增强法免疫大鼠,初次免疫后第2、4、5周采用ELISA法动态观察抗体滴度,并分别于第3、5周分离坐骨神经原纤维及行甲苯胺蓝染色光镜观察。采用ELISA法检测第5周抗血清与GM1抗原的结合反应。神经外膜下注射抗TrxA/PEB1和抗CJ全菌抗原的特异性抗血清,观察其神经病理学改变。结果(1)经两种抗原免疫后,大鼠均产生高滴度特异性IgG,且各自与两种抗原发生交叉反应;(2)以CJPen19全抗原免疫后抗血清可与GM1抗原结合,而TrxA/PEB1免疫者则否;(3)CJPen19免疫组有60%大鼠坐骨神经出现以轴索变性为主的免疫性损伤,而TrxA/PEB1融合蛋白免疫者则未发生;(4)CJPen19免疫血清神经外膜下注射后全部大鼠均发生轴索变性为主的病变,且75%为显著病变,而TrxA/PEB1免疫血清外膜下注射后却未引起明显病变。结论CJPen19全菌抗原和TrxA/PEB1纯化蛋白作为免疫原均可激发大鼠有效体液免疫应答,但与CJ全菌抗原相比,TrxA/PEB1蛋白所产生的全身免疫反应未引起周围神经损伤,其抗血清不含针对GM1抗原的抗体。

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的表达及单克隆抗体的制备

目的表达CJ PEB1重组蛋白,制备并鉴定CJ PEB1蛋白的单克隆抗体。方法诱导培养工程菌E.co-li BL21(DE3)表达CJ PEB1重组蛋白,以PEB1蛋白溶液与等体积的佐剂完全乳化作为免疫原常规免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体。无菌取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,建立杂交瘤细胞株。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水制备抗体,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测腹水中抗体的效价,应用Western-blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的CJ PEB1重组蛋白,蛋白质分子量大小与预计的理论值相符。获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株杂交瘤细胞诱生的腹水,经间接ELISA法检测,腹水中的抗体效价分别为8×104和5×104,经双向琼脂扩散试验检测效价均为1∶16。通过Western-blot鉴定,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与PEB1蛋白特异性地结合;其诱生的腹水与CJ菌液混合出现凝集现象,而与大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等菌液混合均未出现凝集现象。结论成功建立了两株稳定分泌抗CJ PEB1重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株并制备了抗CJ PEB1蛋白的单克隆抗体,为今后研究多种检测CJ的方法创造了条件。

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性及对机体的保护作用。方法以不同剂量的含弗氏佐剂的纯化PEB1重组蛋白为疫苗,分别经皮下注射和肌肉注射的方法免疫Balb/C小鼠,ELISA法测定血清中特异性抗体的含量,MTT法测定细胞增殖效应。CJ菌液攻击实验,观察攻击后小鼠的精神状态、病死情况,并做血液、肠道分泌液细菌培养。结果用PEB1重组蛋白免疫Balb/C小鼠,可诱导出高滴度的特异性抗体,能有效地刺激淋巴细胞增殖,加入刺激原的各实验组SI值均较对照组显著增高。结论PEB1重组蛋白免疫接种后可诱导出高滴度特异性抗体和致敏淋巴细胞,能有效保护小鼠免受大剂量空肠弯曲菌的攻击,是一种比较理想的基因工程亚单位疫苗候选抗原。细菌攻击实验结果表明,PEB1基因工程亚单位疫苗能使实验动物产生有效的免疫保护力,明显降低动物的患病率和病死率,并能有效地降低血液和肠道分泌液的细菌含量。

空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】克隆、表达空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体。【方法】采用PCR方法从空肠弯曲菌Penner19标准株基因组中扩增出PEB1蛋白基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHTb中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的PEB1蛋白,并经Western-blotting证实。然后,在非变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化目的蛋白。用纯化的PEB1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。【结果】在非变性条件下用Ni2+-NTA亲和色谱柱纯化PEB1融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%。用该融合蛋白免疫小鼠后,得到抗PEB1抗体,效价达1:2×105。【结论】成功构建了空肠弯曲菌PEB1基因原核表达载体,并获得了高纯度的PEB1蛋白及其高效价多抗,对进一步制备肠粘膜高亲和力的过敏原重组BCG打下了坚实的基础。

重组空肠弯曲菌PEB1蛋白的大量表达及其鉴定分析

目的 探讨基因工程菌PEB1 E.coli BL21（DE3）大量表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白的稳定性及其纯化方法并鉴定.方法 诱导培养工程菌E.coli BL21（DE3）表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白,经镍琼脂糖凝胶层析柱纯化,透析后通过SDS-PAGE分析纯化后的重组空肠弯曲菌PEB1蛋白分子量大小.结果 挑取的PEB1 E.coli BL21（DE3）单个菌落,经总共17 h的扩增,细菌总数可达1×1010以上.在咪唑浓度为100,200,300 mmol/L时,洗脱液中重组蛋白的含量较高,分子量在31KD左右.结论 基因工程菌PEB1 E.coli BL21（DE3）可大量稳定表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白,经鉴定与空肠弯曲菌外膜蛋白-PEB1蛋白分子量相同.

抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1多克隆抗体的制备与鉴定

目的表达空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体。方法诱导培养工程菌E.coli BL21(DE3)表达空肠弯曲菌PEB1重组蛋白。经镍-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,透析并定量后,常规免疫新西兰兔。收集血清,盐析法粗提IgG,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测抗体效价,并通过Western blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的空肠弯曲菌PEB1重组蛋白。用该蛋白免疫新西兰兔后,获得抗PEB1多克隆抗体。间接ELISA法检测抗体效价为1∶2×104,双向琼脂扩散试验检测抗体效价为1∶8。结论运用纯化的空肠弯曲菌PEB1重组蛋白免疫新西兰兔,获得高效价的多克隆抗体。