PEDV乳酸菌工程菌株对小鼠的免疫效果研究

本研究以引起猪流行性腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为研究目标,利用含有PEDV S基因的植物乳杆菌活载体菌株LP1522-PEDS口服免疫小鼠,应用ELISA试验检测免疫小鼠粪便中SIgA含量、血清中IgG、IL-4、IL-2和IFN-γ含量,评价乳酸菌重组菌株LP1522-PEDS对小鼠的免疫效果。结果表明,首次免疫后,商品灭活疫苗组和工程菌株免疫组粪便中的SIgA、血清中的IgG、IL-4、IL-2和IFN-γ含量较对照组显著升高(P<0.05)。在免疫42~56 d,灭活疫苗组和重组菌株组抗体水平均达到最大值,抗体和免疫因子水平依次为:商品灭活疫苗组>LP1522-PEDS组>空载组≈对照组。随后商品灭活疫苗组、LP1522-PEDS组抗体和免疫因子水平逐渐下降。免疫70 d,商品灭活疫苗组抗体水平降幅度相对较小,工程菌株免疫组降幅较大。结果表明,小鼠口服携带PEDV S基因的基因工程植物乳杆菌LP1522-PEDS后能够诱导机体产生PEDV免疫应答。

单月桂酸甘油酯对PEDV感染3D4/21巨噬细胞基因表达的影响

试验旨在研究单月桂酸甘油酯(ML)对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染3D4/21巨噬细胞基因表达的影响。通过ML对3D4/21细胞活力试验和PEDV在3D4/21细胞中的生长曲线确定最适浓度和最佳时间后,将3D4/21细胞随机分为3组(control组、PEDV组、PEDV+ML组),各组分别以全时添加10µmol/L ML和PEDV感染细胞后添加10µmol/L ML两种方式进行处理,并检测相关基因相对表达量。结果表明:添加10µmol/L的ML对3D4/21细胞生长具有显著的促进作用(P<0.05),病毒感染3D4/21细胞的48 h内PEDV-S、M、N基因相对表达量呈现先增加再降低的趋势,12 h时处于最高;与PEDV组相比,PEDV+ML组全时添加ML处理12 h使PEDV-S、M、N、IL-8、IFN-β、IFITM3基因相对表达量显著下调(P<0.05),处理24 h使PEDV-S、M、N、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1和IFITM1基因相对表达量显著下调(P<0.05),KCNJ13基因相对表达量显著上调(P<0.05)。与PEDV组相比,PEDV+ML组在感染后添加ML处理12 h使MMP13基因相对表达量显著下调(P<0.05),PEDV-M基因相对表达量显著上调(P<0.05),处理24 h使IL-6、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1、IFITM3基因相对表达量显著下调(P<0.05),PEDV-S、M、N、KCNJ13基因相对表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,PEDV感染前ML预处理具有一定的抗病毒效果;PEDV感染使细胞处于免疫应激状态,ML有一定的缓解作用。

PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定

[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

基于网络药理学和分子对接探究白杨素和柚皮素抗PEDV的作用机制及试验验证

【目的】探讨白杨素和柚皮素抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的作用靶点和机制,为进一步以白杨素和柚皮素开发新型抗PEDV的治疗药物提供理论依据。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SEA Search Server和STITCH在线数据库获得白杨素和柚皮素的潜在作用靶点,同时检索GeneCards数据库获得PEDV对宿主的作用靶点,利用在线程序Draw Venny Diagram获取白杨素、柚皮素与疾病的交集靶点。通过STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。通过AutoDock Vina v 1.2.0软件对核心靶点及小分子进行分子对接,并分析白杨素和柚皮素与靶蛋白的结合能和结合模式,利用PyMOL v 2.5实现对接结果的可视化。采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测白杨素和柚皮素对核心靶蛋白表达的影响。【结果】白杨素潜在抗PEDV的靶点有12个,其中白蛋白(ALB)、雌激素受体1(ESR1)、转化生长因子β-1蛋白(TGF-β1)可能是白杨素抗PEDV的核心靶点;柚皮素潜在抗PEDV的靶点有18个,其中ALB、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)可能是柚皮素抗PEDV的核心靶点。白杨素抗PEDV靶点涉及21种生物过程、5种细胞组分和6种分子功能,共获得11条信号通路;柚皮素抗PEDV靶点涉及31种生物过程、8种细胞组分和19种分子功能,共获得13条信号通路。核心靶点与两种天然化合物之间以氢键和疏水作用力为主,有较强的相互作用。白杨素和柚皮素能极显著降低Caspase-3表达量(P<0.01),可能通过影响Caspase-3的表达和活化来颉颃PEDV诱导的细胞凋亡;极显著升高TGF-β1蛋白表达量(P<0.01),可能通过影响TGF-β1的表达抗PEDV诱导的炎症反应而治疗PEDV的感染。【结论】本研究揭示了白杨素和柚皮素分别通过潜在核心靶点ALB、ESR1、TGF-β1和ALB、Caspase-3、PPARG,以及IL17、PI3K-Akt和AMPK信号通路发挥抗PEDV作用的机制,为新型抗PEDV药物的研发提供新的思路。

猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用

人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。

金银花源miR2911靶向PEDV基因区域分析

金银花源miR2911是一种丰度较高、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染和SARS-CoV-2感染中发挥着关键作用。然而,有关miR2911靶向PEDV基因区域的研究却鲜有报道。因此,本研究旨在分析miR2911靶向PEDV的基因区域,进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性。利用miRanda软件成功预测miR2911在PEDV基因组中存在多个靶点,靶向PEDV基因区域保守性很高。为后续深入研究miR2911在抗猪源病毒感染的机理提供了数据支撑。

丁壮素酸乳对PEDV和PRRSV体外增殖的影响

为探究丁壮素酸乳对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)体外增殖影响,本研究使用CCK-8法分别检测丁壮素酸乳对Vero细胞和Marc-145细胞的毒性,采用实时荧光定量PCR分别检测PEDV、PRRSV在不同质量浓度丁壮素酸乳作用下的基因组拷贝数。实验结果显示:100~500μg/mL丁壮素酸乳对Vero细胞和Marc-145细胞活性没有显著影响;200~300μg/mL丁壮素酸乳显著抑制PEDV增殖,100~300μg/mL丁壮素酸乳显著抑制PRRSV增殖。实验结果表明,200~300μg/mL丁壮素酸乳对PEDV和PRRSV的体外增殖具有显著的抑制作用,且无细胞毒性。

不同全自动核酸提取仪对ASFV、PEDV提取效果的比较

【目的】以倍比稀释的ASFV(非洲猪瘟病毒)阳性对照样品以及PEDV(猪流行性腹泻病毒)阳性对照样品为检测对象,对比3款全自动核酸提取仪对DNA和RNA的提取效果,旨在帮助猪场配备的实验室筛选合适、可靠的全自动核酸提取仪。【方法】倍比稀释好的ASFV、PEDV阳性对照样品,每个梯度设置3个平行重复,诺维赞核酸提取仪(VNP-32P)为处理1,西安天隆核酸提取仪(NP968-C)为处理2,博日核酸提取仪(NPA-32P)为处理3,根据3款全自动核酸提取仪及提取试剂盒的说明书将对应阳性样品进行核酸提取,再根据英迪康的virotype?非洲猪瘟病毒2.0 PCR检测试剂盒以及世纪元亨的流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的说明书进行体系配制、上样、程序设置,进行核酸扩增。【结果】同一浓度梯度的ASFV、PEDV阳性对照样品,处理3所提核酸的扩增结果 CT值较处理1和处理2的低,而处理1和处理2提取效果不相上下。【结论】3款核酸提取仪的稳定性都满足需求;博日核酸提取仪(NPA-32P)的提取效果优于另外2款,诺维赞核酸提取仪(VNP-32P)和西安天隆核酸提取仪(NP968-C)的提取效果接近。

贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。

PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ应答的分子机制研究进展

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)具有很高的发病率和死亡率,尤其是在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)高致病性变异株(GⅡ型毒株)出现以来,更是对全球养猪业构成了巨大威胁。病毒感染宿主之后,宿主会激活抗病毒天然免疫应答机制。干扰素(interferon,IFN)作为一类抵御病毒感染的关键分子,特别是Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可通过激活各种免疫细胞和共刺激分子来颉颃病毒的增殖。与此同时,为实现在宿主内的持续复制,许多病毒建立了颉颃宿主机体IFN-Ⅰ应答的多种分子机制,进而实现免疫逃逸。PEDV编码的多种结构蛋白可以颉颃宿主IFN-Ⅰ免疫应答。文章综述了PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ免疫应答的分子机制,以期为深入阐释PEDV免疫逃逸的分子机制与开发PEDV新型靶向药物和建立防控新策略提供科学参考。

莽草酸对PEDV感染仔猪生长性能、腹泻指数、血清免疫及抗氧化指标的影响

试验旨在研究莽草酸对感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)仔猪的生长性能、腹泻指数、血清免疫及抗氧化指标的影响。将120头感染PEDV的7日龄“杜×长×大”仔猪随机分为6组,每组5个重复,每个重复4头猪。处理1组、2组、3组分别每日给感染PEDV仔猪灌服800、400、200 mg/kg莽草酸,处理4组每日给感染PEDV仔猪灌服400 mg/kg绿原酸,处理5组每日给感染PEDV仔猪灌服2万单位庆大霉素,处理6组为阳性对照组,另选选择20头健康仔猪作为空白对照组。试验期为5 d,之后观察3 d。结果显示,与阳性对照组相比,处理1组、2组、3组仔猪平均日增重(ADG)均显著升高(P<0.05)。处理1组和2组仔猪的PEDV感染治愈率均达到85%,处理5组仔猪的PEDV感染治愈率为65%;处理1组、2组、3组仔猪血清中的免疫球蛋白G(IgG)含量均显著升高(P<0.05);处理1组、2组、3组仔猪血清中的总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮(NO)、髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著升高(P<0.05);丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)水平显著降低(P<0.05)。研究表明,莽草酸能够提高仔猪的生长性能,降低腹泻指数,增强血清免疫力和抗氧化能力,对PEDV感染仔猪具有抗病促生长作用。

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法,并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测,结果显示,除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外,其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性,表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测,结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40960,是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2560),表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳,评估该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数分别为0.34%~4.49%和1.90%~8.71%,均小于10%,重复性好。利用该捕获ELSIA和IDEXX PEDV IgA抗体试剂盒分别对50份猪初乳检测,结果显示两种方法对样品检测的OD450nm值趋势高度一致,表明该方法检测结果与IDEXX试剂盒相关性强。利用该捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对100份临床采集的猪初乳样品检测,结果显示二者总体符合率为97.0%。利用该方法对90份免疫背景不同的猪初乳检测,结果显示,未感染PEDV且未免疫PED疫苗的母猪初乳检测结果均为阴性结果,感染了PEDV或接种过PED疫苗的母猪初乳均为阳性结果,检测结果与样品的免疫背景相符。本研究建立的捕获ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与同类进口产品检测结果符合率高,对临床样品的检测结果与其免疫背景相符。本研究为PEDV感染猪初乳的检测及PED疫苗免疫效力的评价提供了一种新的技术手段。

PDCoV、PEAV、TGEV及PEDV“一步法”多重荧光RT-PCR的建立和应用

为快速鉴别检测猪冠状病毒,使用一步法试剂,对猪δ冠状病毒、猪肠道α冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪流行性腹泻病毒的检测方法进行优化,建立了同时检测上述4种病毒的“一步法”多重荧光RTPCR。随后对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评估,并将其用于厦门市规模猪场上述4种腹泻病毒感染的流行病学调查。结果显示:该方法的敏感性高,对上述4种病毒阳性质粒的最低检出限均可达101copies/μL;特异性好,对4种病毒的单一及混合模板进行检测时,均可在相应荧光通道中获得良好的扩增曲线,而对其他病毒和细菌无扩增信号;重复性好,批间试验变异系数小于1.1%。使用该方法对从厦门市53家猪场采集的265份腹泻样品进行检测,4 h即可完成全部检测,猪δ冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的场阳性率分别为18.87%和5.66%,未检出猪肠道α冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒。结果表明,本研究建立的方法敏感性高,特异性及重复性好,操作简便、耗时短,适用于临床大批量样本的检测,可为防控猪腹泻疾病提供有力的技术支持。

不同厂家PEDV-IgA抗体ELISA检测试剂盒的对比分析

为比较市面上常用PEDV-IgA抗体ELISA试剂盒检测结果之间的相关性,挑选不同厂家生产的3款试剂盒检测了68份母猪初乳及78份免疫前后的后备母猪血清,并对检测结果进行了相关性分析。结果表明:不同试剂盒检测初乳和血清PEDV-IgA抗体结果差异较大,在进行实验室检测时,应注意合理选择试剂盒,并科学地分析和利用实验室检测结果。

猪A3Z2基因生物信息学分析及其对PEDV复制的抑制作用

【目的】对猪源载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽蛋白3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide protein 3,APOBEC3,简称A3)家族的A3Z2基因进行克隆、生物信息学分析,筛选稳定表达A3Z2的IPEC-J2细胞,研究A3Z2对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)增殖的影响,以期为研究A3Z2的抗病毒功能奠定基础。【方法】以IPEC-J2细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增猪A3Z2基因CDS区,并对其进行遗传进化和生物信息学分析。构建pcDNA3.1-3×Flag-A3Z2载体,将其转染IPEC-J2细胞后经G418筛选、有限稀释法和单克隆细胞培养,获得稳定表达A3Z2的细胞株。分别采用间接免疫荧光试验和Western blotting方法鉴定A3Z2的表达,采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分析PEDV N基因的mRNA和蛋白表达水平。【结果】猪A3Z2基因CDS区长843 bp,编码280个氨基酸,分子质量约为32.7 ku,不存在跨膜区及信号肽切割位点,主要存在于细胞核中。A3Z2蛋白二级结构由α-螺旋(27.14%)、延伸链(17.86%)、β-转角(6.43%)和无规则卷曲(48.75%)构成。通过细胞筛选获得稳定表达A3Z2的细胞株IPEC-J2-A3Z2;间接免疫荧光方法和Western blotting结果显示,A3Z2能在IPEC-J2细胞中表达。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,细胞株IPEC-J2-A3Z2中PEDV N基因的mRNA和蛋白表达均被A3Z2抑制。【结论】本研究成功克隆了猪A3Z2基因,筛选获得了IPEC-J2-A3Z2细胞株,证实了A3Z2抑制PEDV复制的作用,为研究PEDV与A3Z2相互作用的分子机制和以此为靶点筛选抗PEDV新药提供了思路。

3C样蛋白酶:重要抗PEDV药物的筛选靶标

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)成员。由于冠状病毒的RNA酶缺乏校正功能,PEDV等冠状病毒的基因组易发生变异。

兴城某猪场PEDV S基因测序分析

2021年7月,辽宁兴城某猪场暴发仔猪腹泻,病猪死之率较高。本研究以发病的仔猪为研究对象,取其小肠组织进行猪腹泻病原的确定,并将PEDV阳性的病料进行测序。分析本猪场PEDV毒株S基因与市场上现有活疫苗S基因的同源性,为防控新生仔猪病毒性腹泻和正确选择疫苗提供理论依据。

一例PEDV S-INDEL重组毒案例的复盘分析

山东省烟台市某规模化猪场哺乳仔猪发生以水样腹泻为主要症状的临床案例,采集腹泻病料,荧光定量PCR检测流行性腹泻抗原阳性,阳性样品进行测序分析,遗传进化分析位于新型PEDV毒株中的G1b亚型,首次发现PEDV S-INDEL重组毒。通过紧急防控措施,疫情未发生扩散,通过复盘分析,确定此次疫情来源于引种所致。

贵州省部分PEDV流行株ORF3基因克隆与遗传进化分析

为探究贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传进化情况,对2017—2022年贵州省不同地区13份PEDV阳性腹泻样本进行ORF3全基因扩增、克隆、测序,使用DNAstar、MEGA 7.0软件,对所得序列核苷酸和氨基酸同源性以及突变和遗传进化情况进行分析。结果显示:13份PEDV阳性样品的ORF3基因序列全长均为675 bp,编码224个氨基酸;13条克隆序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%~100%和96.4%~100%;13条克隆序列与经典毒株CV777株ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%~97.3%和94.7%~96.4%,同源性较低;与经典毒株CV777株相比,13条克隆序列在G160A、C243T、C274T、G301A、C450T、A497G存在相同的核苷酸突变,存在4个相同的氨基酸位点突变(V21A、V54I、A101T、N166S);13条克隆序列所在毒株在遗传进化上全部属于GⅡ型,其中GZ220514、GZ342、GZ224、GZ219、GZ423隶属于GⅡb亚型,GZ210112、GZ210129、GZ210220、GZ210714、GZ407、GZ210525、GZ330、GZ370属于GⅡa亚型(表明13份PEDV阳性样品所含毒株均为变异毒株);同一基因型的PEDV毒株ORF3基因相对较保守,但不同基因型差异较大;对所有参比株ORF3基因推导的氨基酸序列与CV777株进行比对,分析认为可以将25S、70V/F、80F、107F/V/L氨基酸突变模式作为GⅡa亚型的分子标记。本试验为分析贵州省PEDV流行以及遗传变异情况提供了参考,并丰富了贵州省PEDV ORF3基因序列。

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段,将其转染至Vero-E6细胞,PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平;RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平,同时检测PEDV滴度变化,以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明:PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时,试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,在48 h时表达量最高,且差异极显著(P<0.01),自噬被激活;RT-qPCR结果显示,TRIM5α的表达呈现上升趋势,在感染48 h时表达量最高,且差异极显著(P<0.01)。siRNA-2的干扰效果最好。干扰TRIM5α后,WB结果显示LC3Ⅱ蛋白表达量降低,自噬受到抑制,且RT-qPCR结果显示PEDV为N、ORF3基因的表达水平显著升高,病毒滴度明显上升。研究表明,TRIM5α通过促进细胞自噬抑制PEDV在Vero-E6细胞中的复制。