pEGFP-C1/U6质粒载体介导的表达MDR1shRNA的质粒构建

为了构建pEGFP-C1/U6载体介导MDR1短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达的质粒,针对MDR1的19碱基大小的片段,分别设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体(命名为pEGFP-C1/U6),两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列,构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明:经酶切、连接后构建成的质粒(pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B),经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变。结论:成功构建了能表达MDR1shRNA的质粒载体pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B,此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.

携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的构建方法研究

目的提高构建携pEGFP-C1的目的基因真核表达载体的成功率。方法通过理论研究结合实验操作经验。结果利用该方法可以高效率的成功构建真核表达载体。结论文章提出的方法简便、通用、高效,可以解决重组DNA载体构建技术中的一系列关键问题,为相关研究提供了必要的理论和技术支持。

重组质粒pEGFP-C1-LRIG1的构建及其在SHG44细胞中的稳定表达

目的构建含目的基因多亮氨酸重复区免疫球蛋白样区1(LRIG1)的重组质粒pEGFP-C1-LRIG1,为胶质瘤等多种上皮源性肿瘤的分子治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法,从人全血总RNA中,扩增出3 282bp的LRIG1cDNA片段,再用XhoⅠ和ClaⅠ双酶切后,定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;免疫细胞化学法检测LRIG1基因的表达情况。结果人LRIG1基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1质粒中;经脂质体转染SHG44细胞后,G418进行筛选,可见转染细胞胞膜上有大量LRIG1蛋白表达。结论成功构建了pEGFP-C1-LRIG1的真核表达载体,为研究LRIG1基因在胶质瘤等多种上皮源性肿瘤中的作用和其治疗奠定一定的实验基础。

pEGFP-C1-miR-335重组质粒的构建及其在乳腺癌细胞中的表达

目的构建携带融合型microRNA(微小RNA)基因miR-335的荧光真核表达质粒pEGFP-C1-miR-335,并观察其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。为研究小RNA基因表达调控机制建立实验基础。方法应用基因重组技术,从人类基因组DNA中扩增miR-335的前体序列,经PCR引物加入酶切位点,酶切后插入荧光真核表达载体pEGFP-C1,构建miR9真核表达载体pEGFP-C1-miR-335,然后进行酶切和测序鉴定重组质粒的正确性。应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入MDA-MB-231细胞,24 h后观察荧光蛋白表达情况,用Northern blot方法检测miR-335表达。结果酶切和测序鉴定证实插入miR-335前体片段序列正确。细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达,60%左右转染细胞发出荧光。Northern blot检测到miR-335表达。结论成功构建pEGFP-C1-miR-335荧光真核表达载体,并可在乳腺癌细胞中有效表达。

pEGFP-C1-反义生存素重组质粒的构建和转染

目的 构建pEGFP C1 反义生存素 (survivin)重组质粒 ,并转染入人MKN 45低分化胃腺癌细胞株。观察转染前后生存素基因的表达及对凋亡的影响 ,从基因水平探讨反义生存素核酸治疗胃癌的分子生物学机制 ,为今后利用反义基因治疗肿瘤提供实验和理论依据。方法 应用基因重组技术构建 pEGFP C1 反义生存素重组质粒 ,通过脂质体转染法转染人MKN 45胃腺癌细胞株 ,以流式细胞仪方法检测细胞凋亡 ,以RT PCR技术检测质粒转染前后生存素基因mRNA的表达。结果 pEGFP C1 反义生存素重组质粒转染MKN 45低分化胃腺癌细胞株后细胞凋亡明显增加 ,G2 /M期细胞减少 ,同时生存素基因在mRNA水平被抑制。结论 反义生存素核酸能抑制细胞增殖 ,减少生存素基因的mRNA表达而促进胃癌细胞凋亡目的 构建pEGFP C1 反义生存素 (survivin)重组质粒 ,并转染入人MKN 45低分化胃腺癌细胞株。观察转染前后生存素基因的表达及对凋亡的影响 ,从基因水平探讨反义生存素核酸治疗胃癌的分子生物学机制 ,为今后利用反义基因治疗肿瘤提供实验和理论依据。方法 应用基因重组技术构建 pEGFP C1 反义生存素重组质粒 ,通过脂质体转染法转染人MKN 45胃腺癌细胞株 ,以流式细胞仪方法检测细胞凋亡 ,以RT

PEGFP-C1-PHF6质粒的构建和鉴定

目的:构建含有PHF6基因的PEGFP-C1-PHF6重组质粒并对重组质粒进行鉴定,为进一步研究其在核仁中的定位和功能奠定基础。方法:野生型293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应从总cDNA中扩增出PHF6基因,上下游分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点,双酶切后将其插入PEGFP-C1质粒中,构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH5α进行克隆,提取质粒进行酶切和测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至Hela细胞株中,Western blot检测PHF6基因蛋白的表达情况。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及DNA测序鉴定结果均证实PHF6基因已正确克隆到PEGFP-C1载体中,Western blot结果进一步证实PEGFP-C1-PHF6重组质粒构建正确。结论:成功并正确构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒。

小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C_3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。

L1-ORF2不同片段对报告基因表达产生不同影响

长散布重复序列-1（Line-1，LI）是重要的人类基因组成分，完整的LI有6kb，在基因组中存在的L，多数是不完整序列，有必要研究LI片段对基因表达的调控作用。PCR扩增LI第二读码框（LI-ORF2）不同位置的280bp片段，共7段，同向8串联按正、反方向分别插入pEGFP质粒GFP基因下游，观察插入序列对GFP报告基因表达的影响。构建的质粒瞬时转染HeLa细胞，经荧光显微镜和Northern检测，不同片段对转录量和终止影响不同。7个片段正序对GFP报告基因的抑制均高于其反序，在正序串联表达载体p280—1＊8和p280—9＊8的GFP基因转录量超过其他280正序插入片段，在反序串联表达载体p280—1＊8as和p280．9＊8as的G即基因转录量超过其他280反序片段。280．1。8、280—9＊8、280—1＊8as和280—9＊8as属于转录终止性序列。Alu在基因组的多数区段与L，分布呈反比，Alu正、反序均对GFP表达有抑制作用，但反序抑制作用高于正序，Alu正序属于转录延伸性序列。280bp片段反序插入的所有质粒荧光阳性细胞均高于正序插入质粒。经碱基分析，L1-ORF2各段均存在A碱基含量多，T碱基含量少的现象，这可能是其正、反序对基因表达影响不同的原因。

从江香猪ApoA1基因的克隆及亚细胞定位研究

试验旨在克隆从江香猪载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,ApoA1)基因,研究ApoA1基因在真核细胞中的亚细胞定位情况。通过提取从江香猪总RNA,采用RT-PCR、目的基因的连接、转化等方法构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoA1重组质粒,并经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确后,转染HEK-293T细胞,36h后观察荧光,分析ApoA1蛋白在真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,从江香猪ApoA1基因与GenBank上公布的野猪序列相比,有6处发生了碱基突变,其中5处为有义突变,分别导致180位氨基酸由丙氨酸变为谷氨酸、185位氨基酸由组氨酸变为谷氨酰胺、186位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酰胺、209位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸;PSORTⅡPrediction和荧光共定位试验结果均表明,ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质,约占总表达量的77.8%。本试验成功克隆了从江香猪ApoA1基因CDS区,且ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质中,为进一步构建ApoA1基因转基因动物模型、开展ApoA1基因与人类因肥胖引起的相关疾病关系的研究奠定基础。

五种重组人源IL-18突变子表达质粒的构建及其在BxPC-3细胞中的表达

目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础。方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平。结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达。

真核表达Hsa-miR-1基因及其检测方法的建立

获得Hsa-miR-1的方法主要由人工合成,需耗费很高的成本与时间。文章通过将Hsa-miR-1前体部分连接至pcDNA3.0,可实现Hsa-miR-1基因的高表达。构建含有Hsa-miR-1基因表达前体的表达载体pcDNA-Hsa-miR-1和含有与Hsa-miR-1基因完全互补序列的检测载体pEGFP-C1-CM1。通过共转染pcDNA-Hsa-miR-1和pEGFP-C1-CM1检测Hsa-miR-1基因的表达,并采用Taqman探针法定量检测Hsa-miR-1基因表达水平,成功构建了可高效表达Hsa-miR-1基因的真核生物质粒pcDNA-Hsa-miR-1,并首次建立起Hsa-miR-1基因的检测系统pEGFP-C1-CM1,该检测系统的建立将为今后Hsa-miR-1在肿瘤细胞中的研究提供准确、快捷的检测方法。

抑制聚ADP核糖聚合酶1活性的短发夹RNA载体构建

目的构建抑制人聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)活性的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达载体。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向hPARP1基因的寡核苷酸,各69对碱基,退火,然后利用BamHⅡ及EcoRⅠ与pSIRENRetroQ载体连接。用EcoRⅠ及BglⅡ切取其中U6启动子及下游的shRNA部分,与pEGFPC1载体重组构建pEGFPC1shRNA载体。结果重组构建的pEGFPC1P1、pEGFPC1P2、pEGFPC1N载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明330个碱基成功插入到预计位点。结论载体的成功构建,为进一步研究聚ADP核糖聚合酶在DNA修复过程中的功能打下基础。

hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析

目的构建包含有核不均一核糖核蛋白(hnRNP)A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1,并对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA,以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因,利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1,在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒,然后将重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况,Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况,最后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA(应激颗粒的标记成分)及DPC1a(加工体的标记蛋白)的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达;EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位,但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNPA1质粒成功构建并表达,应激状态下EGFP标记的hnRNPA1参与应激颗粒的构成。

阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

通过改变转染试剂及DNA用量和转染时间等影响转染效率的重要因素来实现阳离子脂质体lipofectamineTM2000(lipo2000)对PC12细胞的高效转染。结果表明,lipo2000转染PC12细胞的最佳转染条件:lipo2000用量为5μL,DNA 2μg,转染时间为6 h,这种条件下的PC12细胞转染率高达40%,且未影响细胞的正常分泌,这为应用PC12细胞进行神经生物学研究提供了基础资料。

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

目的:构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体,观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW 264.7中的表达。方法:从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pEGFP-C1载体中,筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW 264.7,以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照。采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。结果:扩增出小鼠Ipr1基因编码序列,经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW 264.7得到了成功表达,Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。结论:成功地调取小鼠Ipr1基因,构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW 264.7得到了成功表达。Ipr1编码蛋白定位于细胞核内,提示其是一种调节蛋白。

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的:研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞(DC)的可行性,以及在体外诱导特异性抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。方法:以葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)作为载体,在多聚赖氨酸(PLL)的辅助下,通过静电作用结合MUC1/Y基因的真核表达载体pEGFP-C1-MUC1/Y,在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显微镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MUC1/Y特异性抗膀胱癌(膀胱肿瘤BIU87细胞系)的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况;ELISA法测定基因修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力。结果:pEGFP-C1/-MUC1/Y转染效率为15%左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出显著的MUC1/Y特异性的CTL,对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52%,显著高于对照组T-DC诱导的CTL;在透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。

pEGFP-E1A真核表达载体的构建及其体外抑制SMMC-7721肝癌细胞作用研究

目的构建含有EGFP及Ad5.EIA基因的重组真核表达载体pEGFP-E1A,研究其在体外对肝癌细胞的裂解作用。方法对pUC119-E1A质粒双酶切获得E1A基因,定向克隆带EGFP和neo筛选标记的真核表达载体到pEGFP-C1载体中,构建pEGFP-E1A质粒,通过脂质体导入人肝癌细胞SMMC-7721中,经RT-PCR及间接免疫荧光方法确认EIA基因的导入,DNAladder法检测EIA基因对SMMC-7721细胞的凋亡诱导作用。结果酶切和序列测定结果显示重组质粒构建正确,RT-PCR及间接免疫荧光结果显示,外源性E1A基因已整合于SMMC-7721细胞并获稳定表达,在6小时就导致SMMC-7721出现细胞凋亡。结论初步证实E1A基因在体外对人肝癌SMMC-7721细胞具有诱导细胞凋亡的作用,为进一步探索Ad5.EIA基因的抗瘤作用提供实验基础。

壳聚糖-碳纳米粒的制备及其体外性质的研究

目的制备壳聚糖-碳纳米颗粒并研究其理化性质和体外活性。方法首先,用溶胶法制备出分散性良好的碳纳米粉末,再通过正负电荷相互吸引制备出壳聚糖-碳纳米颗粒;其次,用绿色荧光蛋白(PEGFP-C1)质粒DNA作报告基因,以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA与壳聚糖-碳纳米颗粒结合形成载基因纳米粒;再次,用扫描电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布及表面电位(Zeta电位),MTT试验检测壳聚糖-碳纳米载体对HepG2细胞和COS7细胞的毒性作用,凝胶阻滞实验确定该基因载体的DNA携带率,DNaseⅠ保护实验研究其对所携带基因的保护作用,体外纳米粒导入实验定性评价纳米粒进入在体外进入细胞的活性,并用荧光显微镜观察导入效果。结果壳聚糖-碳纳米粒表面携带正电荷,聚合指数<0.3;与DNA结合后效率较高,且可保护DNA免受DNaseⅠ的降解;经FITC标记后能够成功地进入到COS7细胞和HepG2细胞。结论壳聚糖-碳纳米颗粒能进入到细胞内部,且导入效率较高,可以用作基因递送的非病毒载体系统,值得进一步研究。

人急性淋巴细胞白血病细胞株T细胞电转染条件的优化

目的优化人急性淋巴细胞白血病细胞株细胞(Jurkat T细胞)的电转染条件。方法采用电穿孔的方法,将pEG-FP-C1导入Jurkat T细胞中,通过改变电转时的电压来检测细胞存活率,调节电压、细胞密度、电转质粒数、电转缓冲液,通过流式细胞仪检测质转染效率。结果电转条件在电压140 V、细胞密度107个/毫升、质粒数30μg、电转缓冲液为优化培养基时,电转染效率可达(79.2±3.21)%。本研究为外源基因电转染Jurkat T细胞提供了可靠的试验参数依据。结论本实验通过优化Jur-kat T细胞电转染条件能够有效地提高Jurkat T细胞的电转染效率。