基于低分子量PEI的不同疏水链修饰的梳状低聚物基因载体

为了探究基于低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)基因载体的转染效率,通过Michael加成反应将PEI 600 Da接枝于含有疏水链的生物可降解聚酯上形成系列梳状聚合物,并将之应用于基因载体;利用核磁氢谱和凝胶渗透色谱对聚合物的化学结构与分子量进行了测定,此外,还利用凝胶电泳实验和绿色荧光蛋白实验研究了聚合物与DNA的结合能力及其复合物的转染性能。结果表明:本文方法成功合成了系列低聚物,并对DNA表现出较好的包裹能力;油酸修饰后的低聚物与DNA复合物在质量比为6.4时转染效果与PEI 25 kDa相当。可见,油酸修饰后的脂质体低聚物有作为非病毒基因载体的前景。

PEI-质粒纳米粒子对体外培养新生C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜转染效果观察

目的观察以25kDa线性聚乙稀亚胺(linear plyethylenimine,L-PEI)和分枝PEI(branched PEI,B-PEI)作为表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-C1的载体,转染体外培养新生C57BL/6J小鼠基底膜的效果。方法25kDa线性或分枝PEI与质粒在5%葡萄糖溶液或PBS溶液中形成纳米粒子后,行透射电镜观察纳米粒子表征;按相同方法制备纳米粒子,行凝胶阻滞实验并在培养的293T细胞中行MTT毒性测试,选择毒性较小的PEI类型作为质粒载体在293T细胞检测其转染效果;以最适条件用其转染体外培养新生C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜并行荧光镜观察。结果在相同条件下,B-PEI转染能力略强于L-PEI,但L-PEI毒性明显低于B-PEI;在PBS中制备的L-PEI-pDNA纳米粒子的毒性小于在葡萄糖溶液中制备的该粒子毒性;L-PEI-pDNA纳米粒子在适宜浓度范围可以转染体外培养新生小鼠耳蜗基底膜的螺旋缘纤维细胞、螺旋神经元、支持细胞,但转染效率不高。结论 L-PEI可作为转染新生小鼠耳蜗基底膜细胞的非病毒载体,但需要进一步优化获得更好的转染效果。

新型非病毒纳米基因载体PEI-β-CyD对软骨细胞和骨髓间充质干细胞转染有效性评估

目的评估新型非病毒纳米基因载体聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)对软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2转染的有效性。方法体外培养软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2,MTT法观察并比较PEI-β-CyD和相对分子质量为25 000的聚乙烯亚胺(PEI25KDa)对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性。在不同的N/P(载体有效氮含量/外源基因有效磷含量)复合条件下,利用PEI-β-CyD和PEI25KDa分别转染C5.18细胞和C3H10T1/2细胞,倒置荧光显微镜结合流式细胞仪分析转染效率。结果 PEI-β-CyD对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性均小于PEI25KDa。PEI-β-CyD与PEI25KDa对C5.18细胞的转染效率比较,差异无统计学意义(P>0.05);PEI-β-CyD对C3H10T1/2细胞的转染效率显著高于PEI25KDa(P<0.05)。结论 PEI-β-CyD对于软骨细胞系C5.18及骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2是一种低毒有效的非病毒纳米基因载体,在软骨组织工程和细胞治疗研究及应用领域具有良好的开发前景。

热老化加速下高压套管聚醚酰亚胺复合材料抗拉强度预测

热老化易导致玻璃纤维/聚醚酰亚胺(glass fiber polyetherimide,GF/PEI)电缆套管失效,因此研究GF/PEI复合材料热老化加速作用下的力学性能变化规律对提高电缆套管可靠性至关重要。首先,对GF/PEI复合板进行85~145℃范围内不同温度的热时效处理;然后,对不同热老化温度下的样品进行拉伸试验,测试其抗拉强度,分析不同热老化作用下材料色差变化规律;最后,基于抗拉强度和色差的回归分析结果,采用支持向量回归模型建立色差和抗拉强度之间映射模型,实现抗拉强度预测。测试结果表明,随着热老化作用温度逐渐上升,GF/PEI复合材料的抗拉强度逐渐下降,而色差总体上保持增长趋势,且两者呈现显著相关性。建模结果表明,对比传统的线性回归模型和BP神经网络方法,支持向量回归模型能够更加有效地表征色差和抗拉强度之间的映射关系,且预测GF/PEI复合材料抗拉强度的误差更小。

不同链长RGD多肽对交联PEI体外细胞转染的影响

用固相合成法合成了两种不同链长的含RGD序列的小分子多肽,分别为RGD和GGGGRGDS。用物理共混法制备了含RGD的SS-PEI/DNA复合物。测定了该复合物的电位,研究了RGD的链长和加入量对SS-PEI/DNA复合物在COS-7和CHO中的转染效率的影响。结果表明,由于RGD上的天冬氨酸带负电荷,因此含RGD的复合物电位略有降低。RGD链长对复合物在两种细胞系中的转染影响不大,在COS-7中RGD的转染效率略高于GGGGRGDS,而在CHO中则相反,且随着多肽用量的增加转染效率略有降低。

人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺体外靶向转染肿瘤细胞

为了提高聚乙烯亚胺(Polythylenimine,PEI)类载体对肿瘤细胞的靶向性同时降低其细胞毒性,先用1800DaPEI制备了交联低分子量PEI,然后将人转铁蛋白与之偶联,得到了新型肿瘤靶向性人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺基因载体(TCP)。对所得的TCP的理化特性经行了表征,并检测了其细胞毒性。采用TCP介导pGL-3和pEGFP分别对293T、HepG2和Hela细胞系进行体外转染实验。结果表明:TCP是一种低毒高效的基因载体,在肿瘤细胞中的转染效率显著增强,因为其二硫键可在细胞内还原降解,而且通过偶联的转铁蛋白配体与肿瘤细胞表达的转铁蛋白受体间的相互作用,可增强该载体对肿瘤细胞的转染效率和靶向性。

基因治疗中的非病毒载体

添加、修复或替换基因从而达到直接排除病因是基因治疗的目的，也是用于治疗遗传性和获得性疾病的治疗方法。它包括目的基因、载体和靶细胞三个方面，其中载体在整个传染过程中起着关键的作用。非病毒载体是该研究领域的热点之一，虽然传染效率不如病毒载体，但其无毒、无免疫反应、性质可调且制备方便。该文主要就非病毒载体的转染机制及优化策略作一综述。

超支化聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸苄酯共聚物的制备及性能

以超支化聚合物聚乙烯亚胺为引发剂,天冬氨酸苄酯-NCA为单体,利用热开环聚合法合成了超支化聚乙烯亚胺-聚天冬氨酸苄酯共聚物(PEI-PBLA).用核磁共振波谱对PEI-PBLA的化学结构进行了表征.研究了PEI-PBLA在水溶液及有机溶液中的自组装行为.以芘为荧光探针测定了共聚物在水中形成胶束的临界胶束浓度.以甲基橙为客体分子,研究了共聚物胶束的包覆能力,结果表明,共聚物对客体分子的吸附与溶液的pH值有关.研究了共聚物与质粒DNA的复合发现,PEI-PBLA能够很好地与质粒DNA复合,并且可以避免DNA酶的降解,对其起到一定的保护作用.此聚合物在药物传输、可控释放及基因载体等方面都有着潜在的应用价值.

慢病毒介导沉默PD-L1基因在乳腺癌细胞中的表达

构建含细胞程序性死亡因子配体1(PD-L1)基因的慢病毒载体三质粒体系,并检测其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况。p MAGic 7.1慢病毒表达载体与质粒△8.91和p VSVG用聚乙烯亚胺(PEI)共转293T包装病毒,感染并筛选获得MDA-MB-231稳转细胞系,检测PD-L1表达情况。(1)MDA-MB-231在3种乳腺癌细胞中PD-L1表达量最高;(2)三质粒转染293T细胞48 h后荧光强度增强,达到90%以上;用病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h获得20%左右荧光强度;(3)经筛选的MDA-MB-231稳转细胞系在m RNA水平和蛋白水平低表达PD-L1,其中由p MAGic-sh1包装的病毒干扰能力最强;(4)分别加入病毒后,干扰组细胞增殖能力下降,p MAGic-sh1干扰组细胞在加入病毒7 d后生长速度约为阴性对照的64.77%;(5)混合淋巴实验显示,sh-1干扰组的肿瘤抑制率为35.8%,是正常组的3.06倍,且干扰组的T淋巴细胞活性显著增强。成功通过PEI转染试剂建立了三质粒慢病毒包装体系,该体系获得的慢病毒可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达量,所得的干扰细胞株细胞增殖能力下降,可增强T细胞增殖活性及肿瘤细胞杀伤活性。

聚乙烯亚胺提升慢病毒滴度的研究

[目的]本文旨在解决传统慢病毒生产方法中存在的实际操作复杂或成本高等问题,提高慢病毒生产效率。[方法]使用了以聚乙烯亚胺（PEI）为转染介质,以聚乙二醇6000（PEG6000）为离心浓缩介质的慢病毒生产方法,并对浓缩后的慢病毒进行滴度测定。还对可能影响慢病毒滴度的几个关键因素——转染初始细胞数、N/P值、转染质粒DNA量、佐剂的选择等的作用进行了分析。[结果]在使用15 cm培养皿生产慢病毒的条件下,转染质粒DNA总量10.5μg,N/P=20,PEI浓储液p H值为7.0~9.0,转染时293T细胞数（0.5~2）×107时,可以获得较好的慢病毒滴度。[结论]PEI作为一种新的转染试剂,可以替代磷酸钙和脂质体用于高滴度慢病毒的生产。

基于生育酚修饰的低分子量聚乙烯亚胺基因载体

制备了基于生育酚交联的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)可降解脂质体聚合物基因载体。凝胶阻滞实验结果表明它能很好地包裹质粒DNA,使其免受核酸酶的降解。通过在体外He La细胞和HEK 293细胞中的绿色荧光蛋白转染实验结果表明,这种生育酚修饰的聚合物材料在无血清存在下表现出比"黄金标准"PEI高的转染效率。因此,推测这种材料具备了作为非病毒基因载体的潜在性。

聚乙二醇/聚乙烯亚胺共修饰超顺磁性纳米粒靶向递送多柔比星对脑胶质瘤大鼠的影响

目的考察新型聚乙二醇/聚乙烯亚胺(PEG/PEL)共修饰超顺磁性纳米粒(SPIONs)结合外磁场靶向递送多柔比星(DOX)对脑胶质瘤的治疗效果。方法应用高温热分解法制备SPIONs核心,然后应用PEG/PEI进行表面修饰形成多功能载药纳米粒SPIONs-DOX并对其质量进行表征。将48只大鼠建立C6/SD大鼠脑胶质瘤模型后随机分成对照组、DOX治疗溶液组(DOX)、载DOX的超顺磁性纳米粒溶液组(DOX-SPIONs)、载DOX的超顺磁性纳米粒溶液结合外磁场组(DOX-SPIONs+MF)进行相关药物治疗。应用MRI在体影像学检测结合苏木精-伊红(HE)、锥虫蓝及TUNEL染色综合评价DOX-SPIONs+MF对于大鼠脑胶质的治疗效果。结果实验制备的DOX-SPIONs分散均匀,粒径小,呈圆球形,包封率高,稳定性好,同时又具有pH响应及磁靶向特性,适用于在体脑靶向药物递送。在体磁共振(MRI)检测结果证明:与其他形式的药物治疗组比较,应用DOX-SPIONs+MF治疗组大鼠脑胶质瘤体积显著减少(P<0.05),同时大鼠的生存时间明显延长(P<0.05),另外各组大鼠脑组织HE、锥虫蓝及TUNEL凋亡染色结果证实:相比于对照组及其他各个干预组,DOX-SPIONs+MF治疗组大鼠肿瘤部位药物浓度显著升高,肿瘤细胞凋亡显著增加,细胞数量显著减少。结论在外加磁场的辅助下,新PEG/PEI共修饰型超顺磁性纳米粒能够作为脑胶质瘤靶向药物递送载体,显著提高药物对脑胶质瘤的治疗效果。

新型PEI衍生物在COS-7细胞中的转染与毒性研究

目的:寻找一种新型的转染效率高,毒性低的非病毒基因载体。方法:通过化学方法合成Polyimine-MPEI,然后以不同质量比包裹绿色荧光蛋白质粒,检测在COS-7细胞中的转染效率和毒性。结果:在比例从5到100之间,转染效率均比较理想,能达到1.00E+07以上,Polyimine-MPEI的毒性也很小,细胞的生长率均在80%以上,明显高于PEI25KDa对照组。结论:Polyimine-MPEI是一个很有研究前景的聚合物载体,具有高转染效率低毒性的特点,可以通过延长反应时间,增加分子量,增大转染能力。

E1A基因对肝癌细胞放疗增敏作用及其机制探讨

目的研究腺病毒5型早期区1A(E1A)基因对人肝癌细胞的放射增敏作用及其机制。方法利用多聚乙烯亚胺(PEI)载体将E1A基因转染进人肝癌细胞(7721系)中。7721细胞、转染空载体的细胞(7721-vect)及转染EIA基因的细胞(7721-E1A)分别接受0、2、4、6和8 Gy的6 MV-X线照射,用MTT法检测细胞存活率,观察EIA基因对7721细胞放射敏感性的影响;采用流式细胞术检测E1A基因对细胞凋亡以及细胞周期分布的影响;采用免疫组化染色(SP)法检测E1A基因对人表皮生长因子受体2(Her-2)及核因子κB(NF-κB)表达的影响。结果照射后,7721-E1A细胞存活率明显低于7721细胞[至8 Gy时,(7.91±4.44)%vs.(32.50±9.41)%)](P<0.01)。7721-E1A的凋亡率明显高于7721细胞[至8 Gy时,(88.38±15.06)%vs.(42.67±9.49)%](P<0.01)。7721-E1A的细胞周期中S期显著低于7721细胞[(25.16±7.45)%vs.(40.88±11.44)%](P<0.05),而G2期明显高于7721细胞[(40.69±6.74)%vs.(15.63±5.02)%](P<0.01)。转染EIA基因后能抑制Her-2及NF-κB的表达。结论 EIA基因能够明显提高人肝癌细胞在体外对放射线的敏感性。其作用机制可能与E1A抑制Her-2及NF-κB的表达,促进凋亡并导致S期抑制、G2期阻滞有关。

壳聚糖在离子液体中均相接枝聚乙烯亚胺及其基因转运

以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM]Cl)为反应介质和催化剂,采用羰基二咪唑为偶联试剂,均相合成了壳聚糖/聚乙烯亚胺接枝共聚物(CS-g-PEI).采用红外光谱、核磁共振氢谱等分析手段对接枝共聚物进行了表征,证实了聚乙烯亚胺在壳聚糖分子链上发生了接枝共聚,接枝率达到42%.采用复凝聚的方法制备了CS-g-PEI/DNA纳米复合物,并利用动态光散射、透射电镜、凝胶电泳等技术对CS-g-PEI/DNA复合物的物理化学性质进行了表征.以人宫颈癌Hep-2细胞为宿主细胞、pGL3荧光蛋白为报告基因,考察了CSg-PEI/DNA复合物的体外转染性能.研究发现CS-g-PEI介导的荧光素酶质粒的表达较壳聚糖介导的荧光素酶的表达提高了大约160倍.MTT毒性实验表明,CS-g-PEI/DNA复合物在实验浓度范围内细胞毒性比较低.

主客体组装构建环糊精修饰基因微载体的研究

合成了二茂铁接枝聚乙烯亚胺(PEI-Fc),利用二茂铁与β-环糊精的主客体嵌套作用制备了环糊精修饰聚乙烯亚胺,核磁测定结果显示,每条PEI-Fc链上通过主客体作用嵌套的CD平均为26个.这种基于弱相互作用力的β-环糊精修饰聚乙烯亚胺能有效诱导DNA分子的缔合,在N/P值达到3以上时,可形成表面为正电荷、粒径为150～250 nm的球形粒子.在含10%胎牛血清的DMEM体外细胞培养基中,由于培养基中的蛋白质能够在粒子表面发生静电吸附,PEI-Fc/CD/DNA基因微载体显示出良好的稳定性.HEK293细胞培养结果显示,以表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP为模型,以N/P值为10的PEI/DNA组装体作为对照,N/P值为3、5和10的PEI-Fc/CD/DNA组装体的转染效率均达到对照组的2～3倍,这种基于主客体组装构建的环糊精修饰基因微载体显著提高了基因转染效率。