LINC00319调控PENK调节PI3K/AKT信号通路在骨肉瘤中的机制研究

目的探讨LINC00319调控前脑啡肽(proenkephalin,PENK)调节PI3K/AKT信号通路在骨肉瘤(osteosarcoma,OS)中的机制。方法提取OS患者及非OS患者外周血RNA,qPCR法检测LINC00319及PENK表达水平,分析LINC00319与PENK相关性。在MG63细胞中敲低或过表达LINC00319,qPCR及蛋白质印迹法分别检测PENK的mRNA及蛋白表达。OS小鼠移植瘤模型分为shNC组及shLINC00319组,称量肿瘤重量,免疫组化实验检测肿瘤组织中PENK、AKT、p-AKT、PI3K的表达。MG63细胞分为shNC组、shLINC00319组、shLINC00319+shPENK组,EdU法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞侵袭,蛋白质印迹法检测AKT、p-AKT、PI3K蛋白表达水平。结果相较非OS患者,LINC00319在OS患者外周血高表达,PENK在OS患者外周血低表达,PENK与LINC00319表达呈负相关。敲低LINC00319后,PENK mRNA及蛋白水平上调,过表达LINC00319后,PENK mRNA及蛋白水平下调。相较于shNC组,shLINC00319组小鼠肿瘤重量降低,肿瘤组织中AKT蛋白表达水平不变,p-AKT蛋白表达水平降低,PI3K蛋白表达水平降低。相较于shNC组MG63细胞,shLINC00319组细胞增殖与侵袭能力降低,p-AKT、PI3K蛋白表达水平下降;相较于shLINC00319组细胞,shLINC00319+shPENK组细胞的增殖与侵袭能力以及p-AKT、PI3K蛋白的表达水平均有所升高。结论LINC00319在OS患者外周血高表达,PENK在OS患者外周血低表达,两者表达呈负相关性。LINC00319的高表达通过抑制PENK水平,进而激活PI3K/AKT信号通路促进OS细胞增殖及细胞侵袭。

海马结构内PENK和PDYN基因表达之间关系的探讨

目的 :探讨海马结构内PENK和PDYN基因表达之间的关系。方法 :合成一段与PENKmRNA起始部位互补的 39merAntisense ,同时分别合成PENKmRNA的Sense序列和Missense序列。将三段寡核苷酸硫代化后 ,用微渗透泵通过脑内给药的双通不锈钢管 ,分别将其恒速持续注入清醒自由活动大鼠的一侧腹侧海马结构内 ,并用原位杂交技术观察海马内PENKmRNA和PDYNmRNA的表达。结果 :灌注Antisense侧海马内PENKmRNA的表达较对侧明显降低 ,而PDYNmRNA却较对侧明显增高 ;灌注Sense和Missense的大鼠两侧海马内PENKmRNA和PDYNmRNA的表达未见明显差别 ,提示Antisense选择性阻断PENKmRNA表达后 ,同侧PENKmRNA表达降低的同时PDYNmR NA表达明显增加 ;同时发现对侧PENKmRNA表达增加的同时PDYNmRNA的表达明显降低 ,并且反义寡核苷酸的作用具有序列特异性。结论 :PENKmRNA的表达能抑制PDYNmRNA的表达 。

散偏汤对偏头痛模型大鼠中脑、三叉神经节CGRP、PENK基因、蛋白表达的影响

目的观察散偏汤对偏头痛模型大鼠中脑、三叉神经节降钙素基因相关肽(CGRP)、PENK(PENK)基因、蛋白表达的影响。方法 24只健康SPF级SD大鼠随机分为4组:生理盐水组、偏头痛模型组、琥珀酸舒马普坦组、散偏汤组。颈背部皮下注射硝酸甘油连续3周复制实验性偏头痛动物模型,第2次注射硝酸甘油后给予药物干预,1周后,第3次注射硝酸甘油2 h后取材,Western blotting法测定三叉神经节CGRP、PENK蛋白表达变化;实时聚合酶链反应PCR(Real-time PCR)检测各组大鼠中脑CGRP、PENK基因表达变化。结果 Western blotting法检测:偏头痛模型组大鼠三叉神经节中CGRP蛋白表达与生理盐水组差异有统计学意义(P<0.05),与琥珀酸舒马普坦组和散偏汤组差异有统计学意义(P<0.05),舒马普坦组与散偏汤组差异有统计学意义(P>0.05);偏头痛模型组三叉神经节PENK蛋白表达较生理盐水组降低(P<0.05),散偏汤组和琥珀酸舒马普坦组干预后PENK蛋白表达升高,与模型组差异有统计学意义(P<0.05);Real-Time PCR检测:偏头痛模型组大鼠中脑CGRP基因表达与生理盐水组差异有统计学意义(P<0.05);与琥珀酸舒马普坦组和散偏汤组差异有统计学意义(P<0.05);偏头痛模型组中脑PENK蛋白表达较生理盐水组降低(P>0.05),散偏汤组和琥珀酸舒马普坦组中脑PENK基因表达与模型组比较升高(P<0.05)。结论散偏汤可以抑制伤害性感受传导通路中CGRP的基因及蛋白表达,升高三叉神经节中PENK蛋白的表达,对偏头痛大鼠CGRP基因及蛋白的表达起抑制作用,能抑制痛觉信息的传递,并对内啡肽系统的镇痛作用有一定影响。

重组质粒pVAX1-PENK大规模制备研究

目的：建立质粒pVAX1-PENK的大规模制备2--艺。方法：对大肠杆菌工程菌DH5α-pVAX1-PENK进行补料发酵，利用自行发明的连续碱裂解过程对菌体进行裂解，经超滤浓缩后，用Sepharnse 6 Fast Flow层析柱分离DNA与RNA，再经Plasmidselect Xtra层析柱分离超螺旋质粒DNA与开环或线性质粒DNA，最后经Source 15Q层析柱精制质粒DNA。结果：发酵获得质粒pVAX1-PENK的产率为182mg／L，经碱裂解及层析分离后，最终制备的质粒DNA超螺旋比例大于98％，总回收率为60.5％，纯度（D260nm／D280nm）为1.8～2.0。结论：建立的质粒DNA生产工艺可以制备大量高纯度的质粒DNA，并避免了使用动物源性的酶及有毒试剂。

平肝止痛颗粒对偏头痛(肝阳上亢型)大鼠血浆中ET、PENK含量的影响

目的观察平肝止痛颗粒对肝阳上亢型偏头痛大鼠的镇痛效果,探讨其治疗偏头痛的作用机制。方法使用附子法和硝酸甘油法制作肝阳上亢偏头痛大鼠模型,通过酶联免疫法检测大鼠血浆中内皮素(ET)、前脑啡肽原(PENK)含量。结果平肝止痛颗粒高、中剂量组均能明显减少ET含量,与模型组比较差异显著。头痛宁和平肝止痛颗粒中剂量组可以减少PENK含量,与模型组比较有明显差异。结论平肝止痛颗粒可以有效降低肝阳上亢型偏头痛,其作用机制可能与降低血浆中ET、PENK的含量有关。

PENK基因过表达克隆载体构建及其功能意义

目的构建人前脑啡肽(homo sapiens proenkephalin,PENK)基因过表达克隆载体,研究其功能意义。方法用HIV载体质粒与PENK基因连接,构建成功后用双酶切及测序验证PENK克隆重组体的成功构建。用293Ta包装慢病毒后转染HT1080以测定慢病毒滴度。用PENK-HIV慢病毒颗粒转染PC12细胞,同步设立对照组(未转染PENK),对两组细胞转染后48h采集图片并经行细胞计数,收集细胞,用RT-PCR检测各组中PENK mRNA表达变化。结果 PENK克隆载体酶切及测序结果都验证了克隆构建成功。PENK-HIV慢病毒成功转染PC12细胞48h后,对照组细胞数为88.60±2.55,而PENK转染组细胞数为127.93±2.48,差异有统计学意义(P<0.01)。结论用HIV载体质粒成功构建的PENK克隆重组体可能会促进PC12细胞的生长。

全蝎抗癫痫发作敏感性的阿片肽机制

红藻氨酸（ＫａｉｎｉｃＡｃｉｄ，ＫＡ）癫痫模型，探讨全蝎抗癫痫发作敏感性长期增强的阿片肽机制。本实验选用ＳＤ大鼠，随机分为两组，分别给予生理盐水（ＮＳ）和全蝎粗提液灌胃１０天，１０天后两组均分别颈部皮下注射ＮＳ和惊厥剂量（１０ｍｇ／ｋｇ）的ＫＡ，再分别继续给予ＮＳ和全蝎粗提液灌胃１０天后，用阈下剂量（５ｍｇ／ｋｇ）的ＫＡ检测癫痫敏感性；用Ｆｏｓ免疫反应活性检测海马结构中神经元的兴奋性；用原位杂交技术检测海马脑啡肽原（ＰＥＮＫ）ｍＲＮＡ的动态变化过程。结果显示：实验对照组大鼠癫痫行为敏感性明显增强，脑内癫痫敏感性相关脑区海马齿状回颗粒细胞（ＤＧＣｓ）ｃ－Ｆｏｓ免疫反应阳性细胞数目明显增加，同时海马内具有致癫痫作用的脑啡肽原（ＰＥＮＫ）ｍＲＮＡ表达也明显增加；而实验组动物未见上述改变。本工作证实中药全蝎有明显降低海马神经元兴奋性及抗癫痫发作敏感性形成的作用。

CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖中的相互作用

目的通过观察不同剂量的CCK-8对吗啡依赖SH-SY5Y细胞模型内源性阿片系统的影响,初步探讨CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖过程的相互作用及其机制。方法建立吗啡慢性依赖SH-SY5Y细胞模型,应用放射配基结合技术观察μ阿片受体(MOR)结合特征,应用Real-Time PCR技术检测前脑啡肽原(PENK)、前阿黑皮质素原(POMC)基因的表达,并观察CCK-8对上述指标的影响。结果①10μmol·L-1吗啡作用于全反式维甲酸(RA)分化6d的SH-SY5Y细胞48h,成功建立了慢性吗啡依赖模型;②CCK-8可剂量依赖性地抑制MOR的结合,并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受体拮抗剂(L-364,718,LY-288,513)翻转;③10-7、10-6mol·L-1CCK-8使PENK、POMC的表达较正常组分别增加(5.81±0.84)、(7.26±1.55)倍和(4.55±0.73)、(5.16±0.82)倍。吗啡依赖后,PENK、POMC表达较正常组下降(0.43±0.10)倍和(0.37±0.07)倍,10-8、10-7、10-6mol·L-1CCK-8使下调的PENK、POMC表达增加,PENK与正常组的相对表达值为(0.63±0.10)、(0.86±0.21)、(1.17±0.19),POMC与正常组的相对表达值为(0.46±0.10)、(0.60±0.11)、(0.96±0.11)。10-10、10-9mol·L-1CCK-8对PENK、POMC表达无影响。结论低剂量(10-10、10-9mol·L-1)CCK-8可通过激活CCK受体抑制MOR的结合力,对PENK、POMC的表达无影响;高剂量(10-8～10-6mol·L-1)的CCK-8可使PENK、POMC基因表达增加,促进内源性阿片肽的生成,并可改善吗啡依赖后内源性阿片系统的失衡。

不同间隔时间电针对炎症痛大鼠下丘脑阿片肽基因表达的影响

目的：观察累加电针对炎症痛大鼠模型不同间隔时间的镇痛效果，从而探讨针刺镇痛的最佳治疗间隔时间。方法：96只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和电针组，以佐剂性关节炎大鼠作为炎症痛模型。分别以3、6、12、24h作为电针治疗间隔时间。选用“昆仑”和“悬钟”穴，电针频率15～100Hz，疏密波，电压2～4V，留针20min。连续治疗6d后观测大鼠疼痛级别、痛阈、下丘脑前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA的表达。结果：电针组的疼痛级别明显低于模型组（P〈0．05），24h电针组的痛阈高于模型组（P〈0．01），各电针组下丘脑前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA表达的细胞数均明显高于模型组。在不同间隔时间电针治疗中，以间隔24h治疗更能明显降低炎症痛大鼠的疼痛级别并提高其痛阈，促进下丘脑前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA表达（P〈0．05或0．01）。结论：电针对炎症痛大鼠模型具有非常明显的镇痛作用，间隔24h重复治疗可显著提高其镇痛效果。

不同间隔时间电针对佐剂性关节炎大鼠炎症局部前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA表达的影响

目的:观察不同间隔时间电针对佐剂性关节炎(AA)大鼠的镇痛效应,以探讨针刺镇痛的最佳间隔时间和作用机制。方法:将96只大鼠随机分为对照组、模型组和电针组,每组再分为3 h、6 h、12 h和24 h小组,以Freund’s完全佐剂造成AA大鼠模型,电针选取悬钟和昆仑穴,分别以3 h、6 h、12 h和24 h作为治疗间隔时间,连续治疗6 d,以痛阈、炎症局部前阿黑皮素(POMC)mRNA和前脑啡肽原(PENK)mRNA表达作为观察指标。结果:间隔24 h电针能显著提高AA大鼠的痛阈;不同间隔时间电针均能促进炎症局部POMC mRNA和PENK mRNA的表达。结论:间隔24 h电针可明显提高对AA大鼠的镇痛效应;不同间隔时间电针镇痛效应与促进炎症局部阿片肽基因表达有关。

电针后不同时间佐剂性关节炎大鼠炎症局部阿片肽基因表达的变化

目的:从时效关系角度观察电针对佐剂性关节炎(AA)大鼠镇痛后效应随时间延续的变化规律,并探讨电针镇痛后效应的产生机制。方法:以Freunds完全佐剂造成AA大鼠模型,在电针治疗后1h、3h、6h、12h、24h和48h观测大鼠痛阈、炎症局部前阿黑皮素(POMC)和前脑啡肽(PENK)mRNA的表达。结果:电针治疗后1h、3h、6h、12h,大鼠的痛阈提高,炎症局部的POMC和PENKmRNA的表达增强。结论:电针对AA大鼠镇痛有明显的后效应,可延续12h以上,且后效应的产生与大鼠炎症局部的POMC和PENKmRNA表达增强有关。

人前脑啡肽原绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建人前脑啡肽原(preproenkephalin,PENK)绿色荧光真核表达载体并进行鉴定。方法参照PENK基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自酶切位点。通过RT-PCR的方法从正常人脑组织中扩增出目的基因,并定向克隆至pEGFP-C3绿色荧光蛋白真核表达载体上。筛选阳性克隆,通过双酶切和测序法鉴定重组质粒。结果双酶切结果与目的基因表达的条带完全吻合,克隆测序结果与NCB I收录的PENK序列完全一致。结论成功构建pEGFP-C3-PENK载体,为进一步研究疼痛的基因治疗奠定基础。

地卓西平对吗啡依赖大鼠部分脑区前脑啡肽基因表达的影响

目的:研究谷氨酸受体拮抗剂地卓西平对吗啡依赖大鼠部分脑区前脑啡肽(PENK)基因转录水平的影响。方法:18只雄性Sprague-Dawley大鼠随机等分吗啡组、干预组及对照组,每组6只。吗啡组大鼠腹腔注射吗啡,起始剂量5mg/kg,2次/d,逐日递增5mg,至第10天为50mg/kg;干预组大鼠每次注射吗啡前30分钟腹腔注射地卓西平0.075mg/kg;对照组按平行对照原则注射同体积的生理盐水。末次注射后3h取脑并冰冻切片,留取中脑腹侧被盖区(VTA)、伏隔核(NAc)、中脑导水管灰质(PAG)、杏仁核(AMG)、海马CA1区(HIPCA1)的切片。利用原位杂交及图像分析技术检测各脑区PENKmRNA的水平(吸光度A值)。结果:与对照组相比,吗啡组大鼠各脑区A值均明显降低,干预组大鼠在除AMG外的其它被检脑区也明显降低;与吗啡组相比,干预组大鼠VTA、NAc、AMG、HIPCA1区A值升高。结论:吗啡依赖大鼠多个脑区PENK基因表达明显下调,合并使用地卓西平可在一定程度上拮抗PENK基因表达的下调。