海带PEPC功能区的原核重组表达及功能鉴定

与其他大型海藻一样,海带同样具备无机碳浓缩机制(CCM),以实现高光合作用效率和生产力。胞质磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)被认为是海带CCM的重要组件,但目前尚没有关于海带胞质PEPC相关研究报道。本研究自海带配子体全长转录组数据库中筛选到一条可能位于细胞质的PEPC编码基因的cDNA全长序列。通过RT-PCR方法验证,获得SjPEPC基因的cDNA全长,为3503 bp,包含2850 bp的完整开放阅读框、50 bp的5'-UTR和603 bp的3'-UTR。SjPEPC编码一个含949个氨基酸残基的蛋白,相对分子质量为104.91 ku,等电点为7.31。多序列比对显示PEPC的功能位点在不同物种中高度保守,系统演化及序列结构分析表明SjPEPC属于细菌型的PEPC。选取编码SjPEPC功能区的核苷酸序列,利用同源重组技术构建了pET32a-SjPEPC原核表达载体,经过诱导和纯化,得到了分子质量大小为86.3 ku的重组蛋白(rSjPEPC),酶活性测定结果显示,rSjPEPC具有催化PEP发生羧化的活性,比活力为(9.37±0.46)U/mg prot。研究表明,PEPC在海带无机碳储存中可能具有重要功能。本研究可为进一步解析海带CCM提供了分子和生物化学证据。

干旱和高温胁迫下紫花苜蓿PEPC酶活性变化及其基因序列分析

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种分布极其广泛的多年生优质豆科牧草,分析干热胁迫下其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)酶活性变化及PEPC蛋白的生物信息学。本研究以‘阿尔冈金’紫花苜蓿和云南德钦县野生紫花苜蓿为材料,测定其在干旱胁迫和高温胁迫下的PEPC酶活性的变化,同时扩增了PEPC基因,并对PEPC蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析。结果表明,在胁迫第12 h酶活性达到峰值,两种胁迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于‘阿尔冈金’紫花苜蓿,两种紫花苜蓿PEPC蛋白均为不稳定蛋白和亲水性蛋白。干旱胁迫与高温胁迫都对紫花苜蓿PEPC酶活性产生了较大的影响,且两种紫花苜蓿PEPC氨基酸序列保守性均较高。本研究可为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的光合特性进而增加产量提供理论依据。

玉米pepc基因在杂交转育的转基因水稻后代中的传递和表达特征

在合肥、海南两地以高光效转玉米pepc基因水稻为父本 ,与培矮 64S、2 3 0 2S、2 3 0 4S、2 3 0 6S、512 9、0 2 42 8、皖粳97和双九A等 8个受体杂交 ,转育转pepc基因水稻新种质材料。至 2 0 0 2年已转育成一批转pepc基因水稻品系 ,对这些材料世代跟踪研究显示 :(1)玉米pepc基因以一个显性基因稳定传递给后代 ,符合孟德尔分离规律 ,自交F2 呈3∶1分离 ,BC1为 1∶1分离 ;(2 )玉米pepc基因在杂交转育的转基因水稻中高水平表达 ,与受体亲本相比 ,PEPC活性提高 3 7～ 17 4倍 ,表达水平与受体亲本和转基因拷贝数有关 ,来源相同的世代间有相似的表达水平 ,但同一世代不同个体间表达水平有差异 ,这可能与其位置效应、拷贝数和环境条件有关 ;(3 )杂交后代结实率不高 ,容易产生异交结实导致转基因材料混杂分离。采取抗生素催芽初筛、PCR分析抽检、PEPC活性测定和田间表型观测的转玉米pepc基因水稻选育筛选体系 ,辅之以受体为轮回亲本适当回交可有效地控制。利用该途径已育成 3个稳定的高表达的转玉米pepc基因水稻品系H1596、H1597和Y14 70 ,说明通过常规杂交转育的方法 。

玉米C_4型全长pepc基因导入普通小麦的研究

为了获得具有类似C4光合途径的转pepc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）基因小麦材料,采用基因枪法将玉米C4型全长pepc基因导入小麦材料01H186-20-24,经在含4 mg.L-1L-PPT（L-phosphinothricin,草丁膦）的培养基上筛选,获得抗性再生植株,经PCR检测获得118株T0代阳性植株;进一步利用PCR对T1代植株进行筛选,T2代在隔离条件下种植于大田,Southern blot、SDS-PAGE检测表明,外源pepc基因在小麦基因组中得以整合和表达。测定了40个转基因T2代植株和受体对照的净光合速率（Pn）、PEPC活性,结果表明,在大田自然条件下,82.5%的转基因小麦的Pn增加,最大提高18.57%,达到了28.1μmol CO2.m-2.s-1,转基因植株中PEPC活性为对照的1.5~1.98倍。

转育PEPC基因的杂交水稻的光合生理特性

用高表达的转 PEPC基因水稻 HPTER- 0 1作父本 ,与水稻不育系培矮 6 4 S、 2 9130 S、 70 0 1S以及恢复系 512 9、 4 37进行杂交 ,获得 50 5株后代材料 ,鉴定出 4 2株高 PEPC活性和高光合效率的植株。与其母本相比 ,这些材料的 PEPC活性和净光合速率 (Pn)提高 ,CO2 补偿点降低 ,且 Pn 和 PEPC活性呈正相关 ,r=0 .6 6 6 0 * *。从光合日变化上看 ,转育水稻一天中不同时间的光合速率均显著高于其母本 ,特别中午光合光抑制较轻。从光—光合曲线看 ,其量子效率和饱和光合速率亦显著高于其母本。证明通过杂交可以将转 PEPC基因水稻的高光效特性传递到杂种稻的不育系和恢复系中去 ,为常规育种和生物技术相结合的高光效杂种稻的选育提供了依据。

转玉米pepc基因的杂交水稻亲本的选育

对转玉米 pepc基因水稻进行观察研究 ,发现玉米 pepc基因不仅在水稻中高水平表达而且能稳定遗传。转基因水稻的PEPC活性比非转基因对照提高 10倍以上 ,其单株有效穗、穗总粒数、千粒重和单株产量等主要经济性状指标分别比原始亲本Kitaake提高 14 .9%、5 .7%、1.3%和 13.9%。 1998年以来 ,利用转 pepc基因水稻与杂交稻亲本杂交 ,经 5年 7代选育得出以下结果 :(1)玉米 pepc基因在新遗传背景下仍能高水平表达并能稳定遗传 ;(2 )F1的PEPC活性介于双亲之间 ,其饱和光合速率提高 5 0 % ,与双亲的差异达显著水平 ,利用高光效基因提高水稻杂种优势具有可行性 ;(3)PEPC活性与饱和光合速率呈极显著正相关 (r =0 .6 4 70 ) ,可将水稻叶片中的PEPC活性作为鉴定高光效水稻的主要生理指标 ;(4)转育成 3个较稳定的高光效水稻株系 ;(5 )建立了潮霉素催芽初选、分子标记抽检。

转pepc基因水稻的选育

通过基因工程 ,将玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (pepc)基因导入水稻品种“Kitaake” ,获得高表达的转pepc基因水稻 ,系统选育后 ,获得第 7代稳定种质。转pepc基因水稻的PEPC活性比原种高 2 4倍 ,净光合速率比原种高 5 0 %。以第 7代稳定转基因材料作父本 ,与水稻不育系“培矮 64S”、“2 9130S”、“70 0 1S”以及恢复系“5 12 9”、“Y910 7”、“H9195”、“双九A”和“437”进行杂交 ,获得 80 5株后代材料 ,并从中鉴定出 47株高PEPC活性和高光合效率的植株。这些植株的PEPC活性和净光合速率 (Pn)均高于母本 ,且Pn与PEPC活性呈正相关 ,r=0 666 0 。证明通过基因工程与杂交相结合的方法 。

共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体

用根癌农杆菌共转化的方法将pSB130/CK质粒[目的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK)与筛选标记潮霉素抗性基因HPT分别构建于2个T-DNA区]导入水稻恢复系R299,经PCR、Southern检测,筛选到T0代13个转基因植株。对T1～T3代转基因后代进行PCR跟踪鉴定,分离出无潮霉素抗性基因的转基因植株(PEPC+PPDK+HPT-),分离株系比率为15%～21%,分离株系中PEPC+PPDK+HPT-型单株分离频率为7.2%～10.0%。在T3代成功获得了无筛选标记的转基因纯合系3个(06D351,06D352和06D353),PEPC酶活性和光合速率分析结果表明,其PEPC活性比对照提高了1.5～4.9倍,光合速率提高了19%～40%,说明这些转基因纯系材料在水稻高光效育种上具有很大的应用价值。

PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用

为了明确磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)过量表达能否提高水稻的光合速率,测定了42个表达不同PEPC水平的转玉米PEPC基因水稻株系及对照(受体亲本中花8号)开花期和灌浆期的光合速率。结果表明,在水田条件下,转基因株系光合速率与未转基因对照相比没有明显差异;而在旱地条件下,转基因水稻的光合速率显著高于对照(27%和24%)。随机选取2个PEPC相对活性分别为10倍和25倍的转基因株系进行网室精确控水盆栽实验得到相似的结果。说明单纯导入PEPC并不能提高水稻的光合速率,而干旱胁迫下转基因水稻的光合优势可能是由于PEPC参与水稻的抗旱反应而减轻了干旱胁迫对光合作用的抑制作用。

转PEPC基因水稻对光氧化逆境的响应

为了解析转PEPC基因水稻的光保护机制,比较了转磷酸烯醇式丙酮羧化酶基因水稻(PEPC基因)和未转基因原种(WT)在夏季晴天10 :0 0时和14 :0 0时(光强最强,气温最高)的净光合速率(Pn)、原初光化学效率Fv Fm 、超氧阴离子(O- ·2 )的产生速率以及膜脂过氧化物丙二醛(MDA)的变化,着重研究了自然条件(连体叶片)、人工光氧化(叶圆片浸于蒸馏水)、经外源甲基紫精(MV)处理的连体叶片和叶圆片浸于5mmol LMV溶液中,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的日变化。结果表明,与原种WT相比,转PEPC基因水稻,随光氧化逆境的加剧,SOD和POD诱导活性逐步增强,O- ·2 的产生速率较低,MDA积累较少,维持较稳定的PSⅡ活性和光合能力,表现耐光抑制(光氧化)。可见,与原种相比,转PEPC基因水稻的光氧化耐性与其叶内较高的SOD和POD活性,较稳定的光合速率,PSⅡ活性以及较低的O- ·2 和MDA积累密切相关。

双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株(英文)

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.

麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶pepc基因全长cDNA克隆及序列分析

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C3型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。

蓝藻正反义pepcA基因导入对大肠杆菌中脂类合成的调控

为了探索原核生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)在调控脂类代谢中的作用。PCR法扩增了鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120 PEPC基因中含保守结构域Fa的一段基因片段pepcA,并将其克隆到pMD 18-T载体上。将pepcA正反向连接到穿梭表达载体pRL-489上BamHI位点之间,构建得带有pepcA正反义基因的载体pRL-Sen pepcA和pRL-Anti pepcA,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α宿主细胞中。分析结果表明:pepcA片段的转入对宿主菌的生长影响不大;与野生型细胞相比较,转反义pepcA片段E.coli中PEPC酶活性降低到野生菌的30.2%,蛋白合成减少23.6%,脂类的合成增加了46.9%,;而转正义pepcA片段E.coliPEPC酶活性是野生菌的2.38倍,蛋白合成增加了14.5%,脂类合成减少了49.6%;转基因菌中十八碳酸的含量明显增加。上述结果可能为利用原核生物做生物柴油原料提供线索。

PEPC酶活性作为水稻高光效育种筛选指标的研究

以稳定的转玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pepc）水稻（PC）、未转基因野生型水稻（WT）和PC与9516、苏沪香粳和武育粳3号杂交转育后代为材料,分别测定苗期、分蘖期、拔节期和孕穗期以及花后PC和WT的光合特性。结果表明：①PC叶片的PEPC活性和净光合速率（Pn）在整个水稻生育期都比WT高,其中孕穗期的PEPC酶活性和Pn增加最显著;②与茎和穗相比,花后水稻剑叶的PEPC酶活性最高,叶片的PEPC活性PC和WT在开花后5-10 d剑叶PEPC活性和Pn最大,相对稳定;③开花后第5 d PC剑叶的PEPC酶活性和Pn呈正相关,相关系数为0.923＊＊,其中上午10∶00-12∶00PEPC酶活性表现较高水平且保持相对稳定;④34株转育材料剑叶PEPC酶活性与Pn的相关系数为0.918＊＊。据此认为水稻开花后第5 d到第10 d,晴天上午10∶00-12∶00,剑叶的PEPC酶活性可作为水稻高光效筛选的可靠指标。

转玉米PEPC基因水稻的农艺性状及生理特性

以稳定的转PEPC基因水稻和未转基因野生型水稻为供试材料,测定稻株开花期间地上部干物质的累积量及籽粒中可溶性糖、淀粉和蛋白质含量。结果表明:与未转基因野生型水稻相比,转PEPC基因水稻叶片、茎鞘和穗干重都有部分增加,但以穗增重为主;开花后14 d,与未转基因野生型水稻相比,转PEPC基因水稻籽粒中可溶性糖含量和蛋白质含量显著增加,但其淀粉含量没有增加,推测转PEPC基因水稻籽粒中较多的可溶性糖可能会更多地转化为蛋白质。

转玉米PEPC基因杨树的光合生理特性分析

以转PEPC基因南林895杨和对照(南林895杨)为材料,分析不同转基因植株的光合生理参数。结果显示:转PEPC基因杨树与C4光合途径相关的酶活性比对照增高,PEPC活性增加较为明显,最高达38.6%。转PEPC基因杨树表现较强的对强光利用能力,其光饱和点比对照提高约10%～20%,饱和点时的光合速率比对照高17.7%～58.1%。转PEPC基因杨树光补偿点低于对照,利用弱光的能力增强;CO2饱和点低,比对照低22.2%～44.4%;CO2补偿点也较低,比对照降低58.1%～76.5%,表明对CO2的利用效率较高。此外,转基因杨树羧化效率增高,比对照增加最高达62.3%。

转PEPC基因水稻种质的稳定光合生理特性

本文运用稳定和放射性碳同位素研究了第8代转PEPC基因水稻,并测定其光合速率和荧光特性。结果表明,该种质为C3植物,但C4原初光合产物增多,表现出C4光合特性有所改善;转PEPC基因水稻种质已稳定,为我国的高光效育种提供了一个新的种质资源。

含玉米pepc基因恢复系的MAS转育及其杂交稻的光合特性和杂种优势研究

用玉米pepc基因的特异性引物对转育pepc基因的后代材料进行分子标记辅助选育(MAS),成功地培育出与轮回亲本蜀恢881遗传相似度达97.09%～99.03%的改良蜀恢881,用此改良恢复系与3个不育系冈46A、776A、2480A形成组合。结果表明,(1)自行设计的pepc基因特异性引物能对基因进行准确的筛选,而且玉米pepc基因在新的遗传背景下能够稳定遗传和高水平表达;(2)含有pepc基因F1的PEPCase活力明显地高于对照,PEPCase活力与净光合速率(Pn)极显著正相关(0.6081**),表观量子效率、羧化效率等光合指标也显著好于对照;(3)含有pepc基因F1农艺性状表现各不相同,但千粒重和单株产量表现较为一致,且单株产量较对照平均增加41.48%;(4)776A、Line1和Line6的GCA较高,值得今后进一步考察与利用。

高表达转 C4型 PEPC 基因水稻在低氮下诱导碳氮酶稳定光合作用

为揭示高表达转玉米C4-PEPC基因水稻在低氮条件下的光合表现,采用高表达转玉米C4-PEPC基因水稻(PC)与原种Kitaake(WT)为试验材料,通过盆栽试验,分别测定不同的氮素条件下(中氮300 kg/hm2,低氮65 kg/hm2),开花后不同天数的SPAD值,光合参数以及碳氮关键酶活性。并在开花后50 d收获植株,记录产量因子。结果表明:低氮处理下的PC相对于WT来说,在开花后14,28 d,其净光合速率分别提高了13.10%(P<0.05)和29.29%(P<0.05)。同时,Rubisco羧化酶在开花后14,28 d时活性分别提高了67.86%和52.63%(P<0.05);硝酸还原酶在14,28 d时的活性分别提高79.49%(P<0.05)和17.96%;谷氨酰胺合成酶仅在开花后28 d时活性提高28.48%(P<0.05)。但是通过对产量进行分析,在低氮条件下,并未发现PC的产量与WT有明显差异。可见,PC通过诱导碳氮的关键酶活性的提高维持低氮条件下高净光合速率。

菠萝PEPC基因家族生物信息学分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)在C4和景天酸代谢(CAM)光合途径吸收CO2过程中发挥重要作用,并参与各种非光合作用过程,包括果实成熟、气孔开放、碳氮相互作用、种子形成和萌发以及调节植物对逆境胁迫的耐受性。菠萝为典型的景天酸代谢途径(CAM)植物,为了解磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)在菠萝景天酸代谢途径(CAM)中的作用,本研究鉴定到3个菠萝PEPC基因,按照基因描述命名为AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4,进化树分析结果AcPEPC1和AcPEPC3为植物型PEPC(PTPCs)蛋白,序列同源性较高且基因结构、保守结构域及保守基序均一致。AcPEPC4为细菌型PEPC(BTPCs)蛋白,与AcPEPC1/AcPEPC3间的序列同源性低。组织表达分析表明AcPEPC1菠萝叶片表达量较高,而AcPEPC3和AcPEPC4在菠萝花和果实表达量较高。