PETIA法测定血清胱抑素C方法学的建立

建立了一种纳米胶乳微球增强透射免疫比浊法（PETIA）测定胱抑素C（Cys C）的新方法。方法为在p H值=8.0的磷酸盐缓冲液中,血清中的胱抑素C与测定试剂中经纳米胶乳微球修饰后的胱抑素C抗体反应后形成抗原-抗体复合物,并形成一定浊度,该浊度与样品中胱抑素C浓度成正比。该法线性范围0-8.00mg/L,批内变异系数（CV）和批间变异系数分别为0.88%-2.44%和1.12%-3.12%,回收率为99.0%-103.6%,与参考方法较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.98X＋0.13,r=0.9833。用PETIA法测定血清胱抑素C方法简便、灵敏可靠,适合推广应用。

镁离子增强的PETIA法检测血清胱抑素C试剂研制与评价

研制与评价一种镁离子增强的PETIA法检测血清胱抑素C试剂。在含有聚乙二醇6000和镁离子的pH 7.6的Tris-HC1缓冲液中，胱抑素C与包被有胱抑素C抗体的纳米胶乳微球反应并形成一定浊度，该浊度与样品中胱抑素C浓度成正比。该法线性范围为0~15.00 mg/L，批内和批间精密度（ CV）分别为0.54%~1.81%和0.72%~2.23%，平均回收率为99.9%，该法（ y）与参考方法（x）具有良好的相关性，线性回归方程和相关系数分别为 y =0.9984 x ＋0.026，r =0.9984。所述的试剂测定血清胱抑素C，具有操作简便、线性范围宽、灵敏度高的优点，具有推广应用价值。

颗粒增强免疫透射比浊测定血中Cyst C全自动分析法的建立与评价

目的:建立颗粒增强免疫透射比浊测定血中胱蛋白酶抑制剂C(Cyst C)全自动分析,评价该法常规用于检测血中胱蛋白酶抑制剂C的可行性。方法:将含有Cyst C血样本与乳胶颗粒增强的Cyst C多克隆兔抗体按一定体积比混合,在一定量的兔免疫球蛋白及表面活性剂存在条件下,抗原、抗体结合反应在一定温度、时间内产生一定大小的颗粒,许多颗粒在反应液体中形成一定的浊度,利用Olympus AU2700全自动生化分析仪透射比浊测定,并对方法的不精密度、准确度、干扰试验及与Dade Behring BN ProSpec免疫散射比浊测定方法比较等进行评价。结果:Cyst C浓度为1.03mg/L、5.67mg/L样本的批内不精密度CV分别为4.8%、1.9%。向Cyst C浓度为0.79mg/L、1.18mg/L、1.46mg/L、2.46mg/L样本中加入1.65mg/L的标准液测定回收率分别为100%、95%、85%、87%,平均回收率为92%。样本中的类风湿因子、胆红素、血红蛋白、三酰甘油等干扰物浓度分别达975U/ml、400μmol/L、5g/L、6.7mmol/L时对检测无显著性影响。Cyst C浓度在0.41mg/L^6.60mg/L范围内检测线性良好。血清、肝素抗凝血浆及EDTA抗凝血浆样本测得的Cyst C结果未发现显著性差异(F=0.065,P=0.938)。与Dade Behring BN ProSpec免疫散射比浊测定方法比较有良好的相关性,Y=0.98x-0.054,r=0.997,P<0.01,但两者存在非常显著性差异(P<0.01),本法结果较Dade Behring BN ProSpec免疫散射仪测定结果略低,两种方法的平均偏差为-0.0678mg/L。结论:建立的颗粒增强免疫透射比浊法测定血CystC重复性好、准确度高。血清、肝素抗凝血浆及EDTA抗凝血浆均可用于分析。测定不受类风湿因子(≥975U/ml),胆红素(≥400μmol/L),血红蛋白(≥5g/L)及三酰甘油(≥6.7mmol/L)的干扰。与Dade Behring BNProSpec免疫散射比浊测定方法测定结果比较有良好的相关性,适用于在全自动生化分析仪上作常规检测。

血清胱抑素C在评价系统性红斑狼疮患者肾功能损害中的作用

目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者血清胱抑素C浓度对其肾功能损害的诊断价值。方法:对63例SLE患者采用乳胶颗粒增强透射免疫比浊法测定血清CysC浓度,同时进行尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和24 h尿蛋白定量(UPro)测定,并对SLE组和正常对照组进行统计学分析与比较。结果:SLE组血清CysC浓度1.4984±1.5956,正常对照组血清CysC浓度0.7267±0.1617,P<0.01;SLE患者进行CysC与BUN、SCr、UPro相关性比较,相关系数分别为0.8326、0.9568、0.5263;CysC诊断肾功能损害敏感性明显高于BUN、SCr,对于狼疮性肾功能损害患者,经过治疗,CysC含量逐渐减低。结论:SLE患者血清CysC浓度测定,有助于SLE患者早期肾功能损害的诊断,并为治疗和予后提供依据。

北京地区健康人血浆胱抑素C水平及参考范围

目的调查北京地区健康人血浆胱抑素C（Cystatin C，Cys—C）水平，建立实验室诊断参考范围。方法844例北京地区健康人为研究对象，男413例、女431例。按年龄分为2～20，21～30，31～40，41～50，51～60，61～70，〉70岁共7组。用免疫比浊法、全自动生化分析仪测定。结果844例北京地区健康人不同年龄段Cys—C水平不呈正态分布，差异有统计学显著性意义（男性：P=0．022，〈0．05；女性：P=0．000，〈0．01）。男、女性两组均值水平差异也有统计学显著性意义（P=0．000，〈0．01）。Cys—C水平的总体趋势，2～50岁组比较接近，50岁以上组变化明显。北京地区健康人Cys—C参考范围：总体样本0．39～0．99mg／L（男、女分别为0．42～0．99mg／L，0．37～0．99mg／L）。2～50岁年龄组男0．39～0．79mg／L，女性0．30～0．70mg／L；〉50岁组，男0．48～1．04mg／L，女0．42～0．98mg／L。结论Cys—C的参考范围在不同人群中是不一致的，在临床上评价肾小球滤过率应建立适宜的参考范围。

乐山市健康人群胱抑素C正常参考范围的建立

目的研究乐山市不同年龄和性别的健康人群胱抑素C(Cys-C)正常参考范围。方法采用颗粒增强免疫比浊法检测2687例健康体检人群(年龄3～88岁)血清Cys-C的浓度。用非参数检验比较不同性别和年龄组Cys-C的浓度的差异,用2.5%～97.5%百分数范围,表示95%参考范围。结果乐山市健康人血清Cys-C的频数分布均为非正态性分布,不同性别之间血清Cys-C浓度的差异有统计学意义(P<0.01);按年龄分组后分析显示,女性血清Cys-C的值在Ⅰ组(3～17岁)和Ⅱ组(18～59岁)中无统计学意义,而Ⅲ组(60～88岁)中Cys-C的值显著高于Ⅰ组和Ⅱ组;男性各组间血清Cys-C的值有统计学意义,且血清Cys-C的值随着年龄的增长而升高。各组血清Cys-C的值的95%的参考范围为:男性,3～17岁:0.49～1.05mg/L,18～59岁:0.54～1.14mg/L,60～88岁:0.71～1.63mg/L;女性,3～59岁:0.51～0.97mg/L,60～88岁:0.62～1.54mg/L。结论乐山市健康人群血清胱抑素C浓度存在着年龄和性别的差异,临床医生在应用该检测指标时应注意因年龄和性别不同而带来的变化,选择适合的参考范围。

人胱抑素C单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)的单克隆抗体(McAb),并建立检测人血清Cys C的颗粒增强透射免疫浊度分析法(PETIA)。方法:构建人Cys C的原核表达载体pET32a(+)/Cys C,纯化Cys C重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备Cys C的McAb;以自制的McAb包被乳胶颗粒,建立PETIA法测定血清Cys C,并对其分析性能进行初步方法学评价。结果:建立分泌抗Cys C单克隆抗体的杂交瘤细胞株3株,其分泌的McAb为IgG1,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合;将杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔,腹水中Cys C McAb效价为1∶4×106;用自制的McAb建立定量测定Cys C的PETIA,方法学评价试验结果证实我们建立的PETIA法,与进口试剂有很好的可比性,具有较满意的方法学性能。结论:成功制备了抗Cys C单克隆抗体,该抗体可用于建立定量检测Cys C的PETIA法。

昆明地区健康人群血清胱抑素C参考区间调查

目的调查昆明地区健康人群血清胱抑素C（CystatinC，Cys-C）水平，建立实验室诊断参考区间。方法应用颗粒增强免疫透射比浊法测定130例健康受检者血清胱抑素C浓度；用SPSS16．0软件对检测结果进行统计学处理。结果130例健康受检者的血清胱抑素C浓度与性别、体重指数无关。受检者的血清胱抑素c浓度1-60岁年龄段血清胱抑素C的浓度水平一致，95％的可信区间为0．500-1．120mg／L；大于60岁年龄段95％的可信区间0．670-1．290mg／L。结论胱抑素C的参考范围在不同年龄人群中是不一致的，昆明市健康人群1-60岁血清胱抑素C的参考范围是0．500-1．120rag／L；大于60岁年龄段95％的可信区间为0．670-1．290mg／L，因此在临床上评价肾小球滤过率应建立适宜的参考范围。

降钙素原胶乳增强免疫比浊检测方法的评估

目的对降钙素原(PCT)检测的胶乳增强免疫比浊法进行性能评估,并与化学发光法进行比较分析,判断其临床可接受性。方法按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)的标准,对降钙素原(PCT)检测的胶乳增强免疫比浊法进行精密度、线性、抗干扰及方法学评价,并与化学发光法进行比较。结果在0.5μg/L和2.0μg/L医学诊断水平,胶乳增强免疫比浊法的批内和日间CV值分别<5.0%和2.0%。检测线性范围为0.05μg/L^60μg/L,线性范围内偏差<5.0%。胶乳增强免疫比浊法与化学发光法具有良好的相关性,平均偏倚分别为0.4μg/L和0.6μg/L,其差异无统计学意义。胶乳增强免疫比浊法抗干扰性强,标本总胆红素(≤600μmol/L)、血红蛋白(≤400 mg/dl)、三酰甘油(≤1 000 mg/dl)、类风湿因子(≤200 IU/ml)对PCT的测定均无影响。结论 PCT胶乳增强免疫比浊法与化学发光法具有良好的相关性,因其检测时间短,费用相对较低,因此具有良好的市场前景。

纳米微球增强免疫比浊法测定β_2-微球蛋白方法学评价及临床意义

目的应用NCCLS标准化评价方案对胶乳增强免疫比浊法测定β2-MG进行初步评价,并探讨血清β2-MG在肿瘤疾病筛查中的应用价值。方法测定2000例表观健康人、50例肿瘤患者血清β2-MG浓度。分析测定精密度、准确性、线性范围和抗干扰性。结果批内变异系数为0.46%、0.69%、0.35%;日间变异系数为0.79%、1.65%、1.92%;平均回收率为99.6%。检测线性范围为0.14 mg/L^8.90 mg/L。分别用国内试剂和CLIA法试剂进行比对,r2值分别为0.9997、0.995,有很好的相关性。总胆红素在230.4 mol/L、血红蛋白7.5 g/L、甘油三酯9.6 mmol/L以内,相对偏差<5%。结论胶乳增强免疫比浊法试剂测定血清β2-MG快速、准确、精密度高,可用于肿瘤诊断。

重组人胱抑素C重链单域抗体的制备

研究在大肠杆菌中表达重组人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)重链单域抗体(Variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody,VHH),经纯化和复性后,建立测定人血清Cys C的胶乳增强免疫比浊法(Particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)。根据大肠杆菌编码蛋白的特性设计Cys C重链单域抗体编码基因序列,人工合成目的基因克隆至PET32a(+)载体中,构建重组人Cys C重链单域抗体原核表达质粒PET32a(+)-Cys C重链单域抗体,测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,所获得的目的抗体经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,通过稀释复性,SDS-PAGE鉴定其纯度。Cys C重链单域抗体化学偶联胶乳颗粒,建立PETIA法测定人血清Cys C。SDS-PAGE电泳分析显示,表达的Cys C重链单域抗体相对分子质量约为53 k,经Ni-NTA亲和层析法纯化后抗体纯度达90%以上,复性回收率为60%左右。用Cys C重链单域抗体建立的测定人血清Cys C的PETIA,能检测到血清中的Cys C含量。成功构建Cys C重链单域抗体原核表达系统并获得了有活性的Cys C重链单域抗体,该抗体可用于建立测定Cys C的PETIA法,为下一步开发Cys C的免疫检测试剂盒奠定了基础。