大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2(pleckstrin homology-like domain,family A,member 2)基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分c DNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长c DNA序列;利用ORF Finder和Prot Param等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F1代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】①克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的c DNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。②预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成,并且包含保守的PH(pleckstrin homology)结构域。3BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。4荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高(P<0.01),在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著(P>0.05),在脾中未检测到表达。5印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。6PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著(n=15,R2=0.855,P<0.01)。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性;PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。

印迹基因PHLDA2在孕妇子痫前期胎盘中的差异表达和甲基化状态

了解印迹基因PHLDA2在孕妇子痫前期胎盘中表达水平及甲基化状态变化,我们收集2017年6月—2018年12月于复旦大学附属妇产科医院分娩产妇的临床资料和胎盘组织,分为早发型子痫前期4例,晚发型子痫前期16例,正常对照组30例。采用Real-time PCR和焦磷酸甲基化测序检测和比较三组胎盘组织中印迹基因PHLDA2的相对表达量和甲基化情况。结果发现,与对照组比较,早发型子痫前期PHLDA2 mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P=0.406),胎盘组织中PHLDA2启动子区甲基化程度差异性增加(P<0.001);而晚发型PHLDA2 mRNA的相对表达量有差异性下降(P=0.019),胎盘组织中PHLDA2启动子区甲基化程度差异性增加(P<0.001)。推测子痫前期孕妇胎盘组织中PHLDA2基因的低表达、启动子区高甲基化可能与子痫前期的发病有关。

印记基因PHLDA2表达与骨肉瘤辐射敏感性的研究

目的探讨印记基因PHLDA2在骨肉瘤放疗疗效评估中的意义。方法采用免疫组织化学S-P法和RT-PCR方法在36例放射治疗后的骨肉瘤组织及其配对的癌旁组织中检测PHLDA2分子的表达,并结合临床病例参数及辐射敏感性探讨PHLDA2表达的意义。结果放射治疗后的骨肉瘤组织中PHLDA2分子mRNA和蛋白的表达一致,明显低于配对的癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05);辐射缓解组中PHLDA2的表达阳性率高,与辐射抵抗组差异有统计学意义(P<0.05);但PHLDA2表达与骨肉瘤患者的性别、年龄、病理分型不相关,差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨肉瘤组织中PHLDA2的表达显著降低,其表达可作为一种骨肉瘤放疗疗效评估的参考指标,值得在临床上推广运用。

子痫前期患者胎盘组织PHLDA2基因印迹初步研究

目的观察子痫前期患者胎盘组织母源性印迹基因PHLDA2印迹状态。方法收集21例正常妊娠和19例子痫前期患者胎盘组织,抽提样本DNA,PCR扩增,选择PHLDA2基因组变异比例较高的单核苷酸多态性(SNP)位点:rs13390为外显子1中C/T多态性(PHLDA2-1),rs1056819为外显子2中G/A多态性(PHLDA2-2),直接测序筛选杂合子。将杂合子样本的RNA逆转录合成cDNA,PCR扩增直接测序判断PHLDA2基因印迹状态。结果正常妊娠与子痫前期胎盘PHLDA2-1(外显子1)SNP位点(C/T)均未发现杂合子,全为T/T纯合子;胎盘PHLDA2-2(外显子2)SNP位点(G/A)在子痫前期有4例(4/19)、正常妊娠有5例(5/21)杂合子表达,两组杂合子表达差异无统计学意义(P>0.05)。PHLDA2-2杂合子胎盘组织PHLDA2cDNA均只表达G单等位基因。结论子痫前期胎盘PHLDA2(PHLDA2-1及PHLDA2-2)基因多态性与正常妊娠相似,未发现PHLDA2基因印迹丢失现象。

印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤细胞的放射增敏作用及机制研究

目的探讨印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤放射敏感性的影响及相关分子机制。方法通过基因转染技术，将真核表达质粒pEGFP—C3一PHLDA2导入骨肉瘤U20S细胞，经G418持续筛选获得稳定高表达PHLDA2蛋白的亚克隆细胞。实验分为3组：不转染的空白对照组，U20S；稳定转染pEGFP—C3质粒的阴性对照组，U20S—neo；pEGFP—C3-PHLDA2质粒的稳定转染组，U20S—PHLDA2。采用CKK8比色法测定4和8Gyx射线照射后细胞的增殖活性；克隆形成实验观察0～8Gy照射后细胞的存活能力；AnnexinV／PI染色法检测8Gy照射后的细胞凋亡；Westernblot测定蛋白的表达变化。建立人骨肉瘤裸鼠移植瘤模型，观察10Gy照射后PHLDA2基因的体内增敏效应。结果经筛选获得的骨肉瘤亚克隆U20S—PHLDA2细胞中PHLDA2蛋白表达上调（t=13．73，16．28，P〈0．05）。与U20S和U20S-neo组相比，PHLDA2高表达组在4和8Gy的增殖能力明显降低（t=5．00～8．23，P〈0．05），2～8Gy的克隆形成能力明显降低（t=2．52～-1．26，P〈0．05）；同时照后裸鼠移植瘤的生长抑制作用显著提高（t=3．27、2．91，P〈0．05）。8Gy照后，PHLDA2高表达组的凋亡率为（17．97±1．69）％，高于U20S组的（6．47±1．01）％和U20S—neo组的（7．15-t-O．96）％（t=10．11、9．61，P〈0．05）；同时Caspase-3活性明显提高（t=11．26、10．72，P〈0．05）。结论外源性PHDLA2基因在U20S细胞中稳定过表达能够提高骨肉瘤对x射线的敏感性，其机制可能是通过增强Caspase．3的活性、促进射线诱导的细胞凋亡作用实现的。

牛Phlda2基因的组织表达及生物信息学分析

在人、鼠和猪中,Phlda2基因是一个母源表达的印记基因,编码一种胞浆蛋白,具有与血小板同源的结构域。在牛中,Phlda2基因的结构和功能还不清楚。本研究首先利用RT-PCR方法对Phlda2基因在牛组织中的表达进行了分析,进而采用生物信息学方法对牛Phlda2基因的分子进化、启动子及蛋白的高级结构进行了分析和预测。结果表明,Phlda2基因在牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盘10个组织中均有表达。对包括人、小鼠、牛、猪、原鸡、非洲爪蝉、斑马鱼和袋鼠在内的8种动物Phlda2基因mRNA序列进化进行分析,发现这8种动物的遗传距离小于0.435,且牛和猪遗传距离最近,为0.148,与基因系统进化树分析的结果一致。牛Phlda2基因的启动子最可能位于该基因起始密码子上游487-737bp区域,包括20种转录因子结合位点。牛Phlda2基因编码亲水性蛋白,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;蛋白三级结构包括一个由β片层和α-螺旋构成的血小板同源结构域（PH）。以上研究结果将为进一步研究Phlda2基因的功能和分析基因表达调控的分子机理奠定基础。