MicroRNA-27a靶向PHLPP2促进胃癌细胞增殖和转移的机制探讨

目的研究MicroRNA-27a靶向PHLPP2促进胃癌细胞增殖和转移的机制。方法选取我院2016年1月~2018年1月收治的胃癌患者60例,提取所有患者的胃癌组织和胃癌旁组织,研究MicroRNA-27a靶向PHLPP2促进胃癌细胞增殖和转移的机制。结果在SGC-7901细胞中,miR-27a antagomir与vector-3'UTR-wt共转染后可能会引起报告载体荧光素酶活性的上升,但是在miR-27a antagomir与vector-3'UTR-wt共转染之后,荧光素酶的活性并没有发生较大变化。在AGS细胞中,miR-27a antagomir与vector-3'UTR-wt共转染可能会引起报告载体荧光素酶活性的下降,但是在miR-27a antagomir与vector-3'UTR-wt共转染的报告载体中,荧光素酶的活性并没有发生较为显著的变化。转染miRa antagomir后,SGC-7901细胞中PHLPP2中的mRNA水平和蛋白水平明显上升,转染MicroRNA-27a agomir后,AGS细胞中的PHLPP2的mRNA水平和蛋白水平明显下降(P均<0.05)。结论 miR-327a在胃癌组织和胃癌细胞系中表达上调,MicroRNA-27a能够在胃癌细胞中对PHLPP2的活性产生抑制作用,并且能够促进胃癌细胞的凋亡,对胃癌患者的治疗能够产生一定的积极作用。

PHLPP2在胃癌中的表达及其临床意义探讨

目的探讨PHLPP2在癌旁正常胃黏膜、胃癌原发灶和淋巴结转移灶中的表达差异。并分析PHLPP2表达水平和胃癌病人临床病例特征和总生存时间的关系。方法应用免疫组化方法检测PHLPP2在221例胃癌原发灶、30癌旁正常组织和175例淋巴结转移灶中的表达情况,并统计分析了PHLPP2表达与胃癌临床病理特征及其对生存预后的关系。结果癌旁正常胃黏膜、胃癌原发灶和淋巴结转移灶中的PHLPP2的阳性表达率分别为:70.0%、31.3%和18.3%,组间差异均有统计学意义(31.3% vs. 70.0%, 18.3%vs. 70.0%,31.3%vs. 18.3%, P值均<0.001);并且,PHLPP2的表达与远处转移和TNM分期存在显著相关性;PHLPP2阳性表达的胃癌患者5年生存率为57%,阴性表达胃癌患者5年生存时间仅为35%,差别有统计学意义,P=0.03。多因素生存分析发现PHLPP2是胃癌的独立预后因素(HR 0.56, 95%CI 0.37～0.85, P=0.006).结论 PHLPP2在胃癌及转移淋巴结中呈低表达, PHLPP2阴性与肿瘤远处转移及更差的预后相关。PHLPP2蛋白有可能成为胃癌预后预测的标志物。

PHLPP2在人胶质瘤中的表达及意义

目的研究PHLPP2在人正常脑组织以及脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法选取青岛大学附属医院与安丘人民医院神经外科自2014年12月至2016年10月间手术切除并经病理证实的人脑胶质瘤标本56例,其中I级7例,Ⅱ级19例,Ⅲ级21例,胶质母细胞瘤9例。另取20例因脑创伤行内减压术患者的正常脑组织标本作为对照。应用RT-PCR、Western-blotting分别检测各标本中PHLPP2m RNA和PHLPP2蛋白的表达。结果 RT-PCR和Western-blotting检测结果显示正常脑组织中PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表达最高,不同级别胶质瘤组织PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),且随着肿瘤病理级别的增高,胶质瘤组织中PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表达值降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PHLPP2在正常脑组织和不同级别的脑胶质瘤组织中都有表达,其表达值与肿瘤的病理分级呈负相关,PHLPP2可能作为一个肿瘤抑制基因在胶质瘤的发生、发展中起到关键性的作用。

结直肠癌中PHLPP2、PTEN与p-Akt1表达的相关性及其临床意义

目的检测PHLPP2、PTEN与p-Akt1及其下游分子VEGF、BCL-2及Cyclin D1在结直肠癌中的表达,探讨蛋白表达的相关性及其临床意义。方法采用免疫组化En Vision法和RT-PCR法检测结直肠癌及正常结直肠黏膜组织中PHLPP2、PTEN、p-Akt1、VEGF、BCL-2及Cyclin D1的表达,并分析蛋白表达与临床病理特征及预后的相关性。结果结直肠癌组织中PHLPP2和PTEN阳性率低于正常结直肠黏膜组织;p-Akt1、VEGF、BCL-2及Cyclin D1在结直肠癌组织中的阳性率明显高于正常结直肠黏膜组织(P<0.05)。结直肠癌中PHLPP2与p-Akt1、VEGF、BCL-2、Cyclin D1表达均呈负相关(P<0.05)。PHLPP2、PTEN均阳性的结直肠癌组织中p-Akt1阳性率明显低于其他组;PHLPP2、PTEN均阴性结直肠癌组中p-Akt1阳性率明显高于其他分组(P<0.05)。PHLPP2、PTEN蛋白表达水平与分化程度及淋巴结转移具有相关性;p-Akt1蛋白表达水平与分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。Kaplan-Meier分析显示,PHLPP2、PTEN、p-Akt1与结直肠癌患者预后相关。Cox回归模型分析显示,PHLPP2、PTEN、p-Akt1、分化程度及淋巴结转移是结直肠癌预后的独立危险因素。结论 PHLPP2与PTEN做为抑癌基因共同影响Akt1磷酸化,PHLPP2在结直肠癌中表达缺失与肿瘤的发生、发展及转移密切相关,可作为评估结直肠癌患者预后的潜在分子标志物。

食管鳞癌组织中PHLPP1及PHLPP2的表达及其临床意义

目的 :探讨PHLPP1及PHLPP2在食管上皮内瘤变及食管鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法 :采用q RT-PCR方法检测40对食管上皮内瘤变及其正常对照组织和63对食管鳞癌及其正常对照组织中PHLPP1及PHLPP2 m RNA的表达情况,并探讨其表达量与临床病理资料的关系。结果:食管鳞癌组织中PHLPP1和PHLPP2 m RNA的表达水平均明显低于正常对照组织及上皮内瘤变组织(P<0.05)。食管上皮内瘤变组织中PHLPP1和PHLPP2 m RNA的表达水平与正常对照组织无统计学差异(P>0.05)。病理分级Ⅲ级的食管鳞癌患者组织中PHLPP1和PHLPP2 m RNA的表达水平均明显低于Ⅰ~Ⅱ级患者(P<0.01),TNM分期Ⅲ期的食管鳞癌患者组织中PHLPP1和PHLPP2 m RNA的表达水平均明显低于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.01)。结论 :PHLPP1及PHLPP2表达水平与食管鳞癌发生发展与恶性程度密切相关,有望成为食管鳞癌诊断的新靶点。

microRNA-205靶向抑制PHLPP2促进子宫内膜癌细胞增殖侵袭

目的:研究miR-205在人子宫内膜癌细胞中的生物学功能及可能作用机制,探讨miR-205作为子宫内膜癌靶向治疗的潜在靶点的可能性。方法:荧光定量PCR测定人子宫内膜癌细胞株AN3CA、HEC-1-A和Ishikawa以及人正常子宫内膜细胞(CP-H058)中miR-205表达。通过转染miR-205 mimics或miR-205 inhibitor上调或下调子宫内膜癌细胞中miR-205表达,CCK-8和平板克隆形成实验测定细胞增殖活力,Transwell侵袭实验测定细胞侵袭。TargetScan7.1数据库预测发现PHLPP2(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2,含有PH结构域亮氨酸丰富的磷酸酶2)mRNA的3'非翻译区存在miR-205的结合序列。采用双荧光素酶报告基因实验进一步验证。Western blot检测上调或下调miR-205后靶蛋白表达。结果:人子宫内膜癌细胞株AN3CA、HEC-1-A和Ishikawa中miR-205相对表达均显著高于正常人子宫内膜上皮细胞(P<0.01)。与阴性对照相比,上调Ishikawa细胞中miR-205表达,能促进Ishikawa细胞的增殖及侵袭;下调AN3CA细胞中miR-205表达,能抑制AN3CA细胞的增殖活性及侵袭能力(P均<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果发现,与转染阴性对照相比,转染miR-205 mimics至Ishikawa细胞,或转染miR-205 inhibitor至AN3CA,作用于PHLPP2的3'-非翻译区(野生型,含miR-205正常结合位点序列),能减少或升高相对荧光素酶活性(P均<0.01);但在Ishikawa中转染miR-205 mimics,或在AN3CA中转染miR-205 inhibitor,与PHLPP2的3'-非翻译区(突变型,构建miR-205结合序列突变位点)作用,都未能改变荧光素酶活性。Western blot分析显示,在Ishikawa细胞中上调miR-205能降低PHLPP2蛋白表达;而在AN3CA中下调miR-205升高了PHLPP2蛋白表达。结论:miR-205靶向抑制PHLPP2在子宫内膜癌细胞中发挥促癌作用。miR-205与PHLPP2可能成为子宫内膜癌靶向治疗的靶标。

PHLPP2与Akt表达对NSCLC紫杉醇耐药的临床意义

目的研究PHLPP2在紫杉醇耐药非小细胞肺癌组织中的表达及其与Akt表达的关系。方法采用免疫组化方法分别检测160例非小细胞肺癌组织中的PHLPP2、Akt表达,分析PHLPP2在紫杉醇耐药组和非耐药组非小细胞肺癌组织细胞中的表达高低及其与Akt表达的关系。结果(1)PHLPP2在低中分化肺癌组织内的阳性表达为39.8%,高分化肺癌组织内的阳性表达为70.2%,两者表达存在显著性差异(χ^2=13.539,P<0.001)。(2)Akt在Ⅳ期的阳性表达为77.0%,在Ⅲb期的阳性表达为56.7%,两者表达存在显著性差异(χ^2=7.297,P<0.05)。在淋巴结转移的阳性表达为83.3%,在无淋巴结转移的阳性表达为44.8%,两者表达存在显著性差异(χ^2=25.804,P<0.001)。在不同的分化程度、性别、年龄、肿瘤最大直径、组织学类型的表达差异均无显著性(P>0.05)。(3)PHLPP2表达在TP方案耐药组中低表达率高于非耐药组,差异有统计学意义(P=0.043)。(4)Akt表达在TP方案耐药组中高表达率高于非耐药组,差异有统计学意义(P=0.022)。结论PHLPP2可能通过调节Akt水平减少NSCLC对紫杉醇治疗的耐药性。

骨髓间充质干细胞源外泌体miR-21-5p通过下调PHLPP2促进前列腺癌PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)来源的外泌体对前列腺癌细胞PC-3的增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:采用q PCR检测miR-21-5p在前列腺癌细胞系中的表达水平。采用电子显微镜观察BMSC分离出的外泌体形态,Western blotting检测外泌体表面标志物的表达以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-21-5p和同源血小板富亮氨酸复重蛋白磷酸酶2(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2,PHLPP2)的靶向调控关系。向PC-3细胞培养液中加入10μl的BMSC外泌体悬液(Exo组)、转染sh-PHLPP2或antagomiR,CCK-8和Transwell实验检测PC-3细胞增殖和迁移能力。结果:miR-21-5p在前列腺癌PC-3细胞系中高表达。成功分离BMSC培养液上清中的外泌体,透射电子显微镜下观察到外泌体典型的囊泡状结构,且表达CD9、CD63和CD81等特异性蛋白。Exo组中PC-3细胞的增殖、侵袭[(421.34±22.45)vs(200.09±14.22)个,P<0.05]、迁移能力和N-cadherin、Vimentin和miR-21-5p的表达水平均显著高于对照组(均P<0.05)。证实PHLPP2是miR-21-5p的靶基因。与对照组相比,Exo组和sh-PHLPP2组PC-3细胞中PHLPP2的表达明显降低(0.66±0.09、0.42±0.05 vs 1.09±0.08,均P<0.01),细胞增殖、侵袭和迁移[(87.23±12.67)%、(82.45±10.13)%vs(66.46±9.13)%]能力均显著提高(均P<0.01),E-cadherin表达水平显著降低而N-cadherin和Vimentin表达水平显著升高(均P<0.05)。结论:miR-21-5p在前列腺癌PC-3细胞系中高表达,BMSC外泌体miR-21-5p通过靶向下调PHLPP2提高PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

PHLPP2基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及对舌癌细胞Tca8113增殖的影响

目的构建稳定表达PHLPP2小发夹RNA(shRNA)的Tca8113细胞系,研究敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化水平和Tca8113细胞生长的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成针对PHLPP2基因的shRNA,并将其克隆到shRNA表达载体PSIH-H1上。经测序成功后,包装病毒并感染舌癌细胞Tca8113,建立敲低PHLPP2的稳定细胞株。通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹实验检测RNAi的干扰效果。利用Western印迹实验和细胞生长曲线检测敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化及细胞生长的影响。结果经测序证明,成功构建PHLPP2 shRNA真核表达载体。qRT-PCR和Western印迹实验证明,构建的shRNA能有效抑制PHLPP2的表达,并构建敲低PHLPP2基因的Tca8113稳定细胞系。实验表明,敲低PHLPP2可促进细胞的生长并升高Akt Ser473的磷酸化水平。结论成功构建PHLPP2基因的shRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制PHLPP2基因的表达,且能升高Akt Ser473的磷酸化水平并促进细胞的生长,为进一步研究PHLPP2在舌癌中的功能及机制奠定了基础。

磷酸酶PHLPP2抑制GPX4活性增强非小细胞肺癌铁死亡诱导剂RSL3敏感性的作用分析

[目的]探讨磷酸酶PHLPP2在铁死亡诱导剂RSL3诱导非小细胞肺癌细胞铁死亡发生中的作用及机制。[方法]体外培养人肺癌细胞株,GPX4抑制剂RSL3处理后MTT法检测RSL3抑制非小细胞肺癌细胞增殖作用,实时荧光定量PCR检测mRNA水平,Western blot法检测蛋白表达。流式细胞术检测脂质ROS水平,分别采用逆转录病毒/腺病毒感染上调/下调PHLPP2表达,两组间比较采用独立样本t检验。[结果]RSL3有效抑制非小细胞肺癌细胞的活力,RSL3处理后HCC827、H1975、H1650、A549和H1299细胞的增殖率分别为15.22%±2.35%、25.05%±5.92%、4.40%±1.61%、41.48%±10.01%和13.17%±2.54%。PHLPP2表达水平最高的H1650细胞对RSL3抑制增殖作用最显著,RSL3抑制增殖作用与PHLPP2表达水平呈正比。上调PHLPP2表达可以增加RSL3对A549细胞增殖抑制作用,并增加铁死亡关键标志脂质ROS的累积,A549-vector和A549-PHLPP2组的脂质ROS水平分别为4.34%±0.39%和15.36%±0.80%(P<0.001);相反,下调PHLPP2表达H1650细胞中,RSL3对H1650细胞增殖抑制作用减弱,减少了其诱导的脂质ROS的累积,H1650-shControl和H1650-shPHLPP2脂质ROS水平分别为14.76%±1.22%和4.89%±1.81%(P=0.0015)。公共数据库挖掘分析PHLPP2与铁死亡关键蛋白GPX4、SLC7A11和ASCL4的相关性,发现PHLPP2与GPX4表达呈负相关(r=-0.336,P<0.001)。Western blot进一步验证了上调PHLPP2表达可增强RSL3对GPX4蛋白的抑制作用。[结论]PHLPP2促进GPX4抑制剂RLS3诱导铁死亡发生,其机制主要通过协同抑制GPX4活性。

溃疡性结肠炎小鼠血清miR-23a-3p和miR-27a-3p的表达水平及其作用的研究

目的·探究miR-23a-3p和miR-27a-3p在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠血清中的表达及其可能的作用机制。方法·将20只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和模型组,每组10只。模型组小鼠采用含有5%硫酸葡聚糖钠(dextran sulfate sodium,DSS)的饮用水诱导7 d,诱导期间观察小鼠一般情况、粪便形态以及隐血状况;7 d后,采集小鼠全血和结肠组织,测量结肠长度并称取湿重。qRT-PCR检测血清中miR-23a-3p和miR-27a-3p的表达,Western blotting检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ,coactivator 1α,PPARGC1A)、PH域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase,PHLPP2)、B淋巴细胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2,BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)、细胞色素C(cytochrome c,CYT-C)和胱天蛋白酶3剪切体(cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases,cleaved-caspase-3)蛋白表达。结果·DSS诱导后,模型组小鼠出现精神萎靡、体质量减轻、腹泻、肉眼血便等症状,结肠长度缩短、湿重减轻(均P<0.05),小鼠UC模型构建成功。与对照组比较,模型组小鼠血清中miR-23a-3p和miR-27a-3p表达明显下调(均P<0.05),结肠组织中PPARGC1A、PHLPP2、BAX、CYT-C和cleaved-caspase-3蛋白表达显著升高(均P<0.05),而BCL-2表达显著降低(P<0.05)。结论·miR-23a-3p和miR-27a-3p在UC小鼠血清中呈低表达水平,可能通过介导结肠组织中PPARGC1A和PHLPP2表达上调,触发线粒体途径诱导细胞凋亡,从而参与了UC的发生/发展。

不同照射方式对结直肠癌CL187细胞的抑制作用和分子机制初探

目的研究单次、分次和^125I粒子持续低剂量率照射对结直肠癌CL187细胞生物学效应的影响。方法实验分高剂量率单次照射组（400cGy／min，单次组）、分次照射组（2Gy／次／d，400cGy／min，分次组）和^125I粒子持续低剂量率照射组（2．77cGy／h，^125I组）。3组细胞照射0、2、4和8Gy后，24和48h进行细胞计数和锥虫蓝染色，比较细胞总数和细胞存活率的差异。利用克隆形成实验比较3组细胞增殖能力的差异。通过流式细胞仪检测细胞凋亡。蛋白免疫印迹法分析PHLPP2、PTEN和Bax蛋白表达的变化。结果与单次组和分次组相比，^125I组细胞总数减少（t=34．28和29．48，P〈0．05）、存活细胞比例减少（t=-12．38和-14．61，P〈0．05），细胞克隆形成能力下降，相对生物学效应是1．41。照射后48h细胞凋亡检测发现^125I组细胞凋亡比例增加（t=-15．08和-11．99，P〈0．05）。蛋白免疫印迹法检测发现“’I组Bax表达量升高，PHLPP2和PTEN的表达量3组间差异无统计学意义。结论单次、分次和持续低剂量率照射后细胞PHLPP2蛋白表达水平均升高，但剂量率的高低并不影响其表达水平。不同方式照射后，凋亡相关蛋白Bax的表达水平上升，^125I组升高更加明显，^125I持续低剂量粒子照射可能通过影响凋亡相关蛋白Bax的表达水平实现对结直肠癌CL187细胞的杀伤作用。