黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析

通过对黑曲霉N2 5植酸酶phyA基因PCR扩增 ,获得了一条长约 1 6kb的特异性PCR产物 ,并进行了酶切鉴定。然后在pUC1 8质粒中构建了含有目的基因片段的克隆质粒pFNP 1。DNA序列测定表明 ,目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列 ,phyA基因全长1 50 6bp,其中包含一段长 1 0 2bp的内含子 ,编码 467个氨基酸 ,5’端有一段编码 1 9个氨基酸的信号肽序列。黑曲霉N2 5与产植酸酶酶活最高的天然黑曲霉标准菌株NRRL31 35的植酸酶phyA基因 (GenBankAccession :M94550 )相比较 ,其同源性为 96 746% ,编码的氨基酸序列同源性为 97 64%。将黑曲霉N2 5植酸酶phyA基因序列及其相应的氨基酸序列在国际基因库中注册 (注册号分别为 :AF2 1 881 3,AAF2 5481 1 ) ,此基因是目前中国在国际基因库中注册的第一个植酸酶phyA基因。

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。

高效表达黑曲霉PhyA基因改善白三叶草对有机态磷的利用

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒介导遗传转化途径,建立了高效表达黑曲霉PhyA基因的白三叶草转基因系。PCR和Southern印迹结果表明,PhyA基因已整合到转基因植株的基因组中。Northern印迹结果表明,部分转基因系中的PhyA基因具有高表达水平。此外,PhyA基因表达的植酸酶在Patatin信号肽的引导下具有分泌至细胞间隙和根际的能力。与未转基因对照相比,在以植酸盐为唯一磷素供源的条件下,高表达PhyA的转基因系植株的磷素累积量、鲜重和干重显著增加。证明外源转化黑曲霉PhyA基因能显著增强白三叶草利用有机态磷的能力。

光周期与温度对紫花苜蓿phyA和phyB mRNA表达的影响

通过探讨不同温度和不同光周期对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)phyA和phyB mRNA含量的影响,以期为揭示调控苜蓿秋眠性的分子机理提供科学依据。试验采用FQ-PCR SYBR-Green I方法,测定了每天8,12和16h光照处理条件下3种秋眠类型苜蓿WL-232(秋眠型,FD2)、ArcherⅡ(半秋眠型,FD5)、WL-525(非秋眠型,FD8)的phyA和phyB mRNA表达水平;采用半定量RT-PCR,测定了5℃,15℃,25℃和35℃条件下秋眠型苜蓿Vernal(FD2)的phyA和phyB mRNA表达水平。结果表明:苜蓿存在光周期效应,短日照条件下秋眠型苜蓿phyB mR-NA表达量最大,相同光照条件下不同秋眠型苜蓿的表达规律为秋眠型>半秋眠型>非秋眠型,且相对于phyA,在紫花苜蓿绿叶中phyB对光周期的变化反应更敏感。在不同温度条件下秋眠型苜蓿Vernal的phyA和phyB合成规律不一致,低温条件下,phyB表达量较高,phyA表达量较低;高温条件下,phyA表达量较高,phyB表达量较低。上述结果表明phyB在调控苜蓿秋眠中发挥了更重要的作用。

真菌植酸酶phyA基因研究进展

植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶。本文综述了真菌植酸酶 (EC 3.1.3 .8)phyA基因的研究进展 ,主要包括 :①phyA基因的分子生物学特点 ;②phyA基因组文库的构建 ;③phyA基因表达载体的构建 ;④phyA基因表达的调控 ;⑤phyA基因克隆及表达实例。

拟南芥光敏色素基因PHYA转化菊花的研究

光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物的重要光受体,拟南芥包含PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5个光敏色素基因,它们在植物的生长发育中起着重要作用,光敏色素基因的过量表达通常造成转基因植株株型及光合效率的改变。从拟南芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物表达载体,通过根癌农杆菌LBA4404转化地被匍匐小菊"粉地毯",得到4株PCR反应呈阳性的转基因株系。结果发现,与对照相比,在弱光环境下转基因植株节间变长,叶片瘦长,叶柄变长;在露天栽培条件下,转基因株系的叶片变大,叶片着生密,节间变小,株型明显矮化。转基因株系的另一明显表现型是花期显著提前,转基因植株的花色也由粉色变为黄色,拟南芥PHYA基因的过量表达同时也影响了地被小菊生长发育的诸多方面,为PHYA基因在植物基因工程中的应用提供了借鉴。

天女木兰MsPHYA基因的表达及休眠解除功能研究

光敏色素通过感知光信号来参与调控植物种子萌发,其中PHYA是吸收远红光信号的主要光受体。为了探究天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch)种子休眠解除的分子调控机制,对天女木兰光敏色素相关基因PHYA基因(MsPHYA)展开研究。从天女木兰种子中克隆MsPHYA基因(MZ221928)cDNA全长序列,采用qRT-PCR的方法测定MsPHYA基因和MsPIF3基因在不同光质处理下在天女木兰种子中的表达量,MsPHYA基因在天女木兰不同组织中表达量,测定不同光质诱导的种子萌发率,构建pGS-21T-MsPHYA原核表达载体,纯化并复性重组蛋白。研究结果表明:MsPHYA蛋白序列包含PAS结构域、GAF结构域、Phytochrome Region和His kinase结构域。MsPHYA基因在子叶和长枝中高表达,在远红光处理下MsPHYA和MsPIF3基因表达量先升高后下降。不同光质诱导种子萌发率从高到低顺序为红光>黑暗>远红光。天女木兰MsPHYA基因受远红光刺激而上调表达,但远红光处理并没有促进天女木兰种子萌发,推测MsPHYA基因并不直接调控天女木兰种子休眠,其休眠解除同时受MsPIF3调控。成功构建pGS-21T-MsPHYA载体并获得纯化蛋白,制备的MsPHYA抗体具有较好的特异性,可用于蛋白丰度分析。研究结果为揭示光解除种子休眠机制提供理论依据。

phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建

直接以黑曲霉菌株F2 4 6基因组为模板 ,对植酸酶基因phyA的成熟肽 (分子长度为1347bp)进行了PCR扩增 ,再将PCR产物克隆入 pMD 18 T质粒 ,经DNA测序鉴定正确后 ,亚克隆入表达载体 pET30a+和 pMG36e ,成功构建了phyA基因 2种新型表达载体。植酸酶 phyA基因2种新型表达载体的构建 ,为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。

黑曲霉植酸酶基因phyA的克隆及在大肠杆菌中的表达

为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶的分子量约为51kDa。在0.4g·L-1的IPTG的诱导下,植酸酶活性最大(1174U)。

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究。方法:以植酸酶高产菌株─黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子。对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究。结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上。该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022。重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL。结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础。

建立紫花苜蓿PHYA和PHYB mRNA表达水平FQ-PCR检测方法

紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)体系,本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA,PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段,将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBR Green I双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法,对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性,经测序鉴定目的片段已插入pMD18-T载体内,重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性,我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量,结果证明:所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确,适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测

对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆,获质粒pTA-phyA,酶切后,使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上,随后将重组质粒转化给大肠杆菌,验证其成功后,再将重组质粒转化给毕赤酵母,诱导其表达,通过测定植酸酶活性,得出其表达量。

植酸酶phyA基因的密码子优化及其在大豆中的表达

植酸是植物源食品中的主要抗营养成分,降低植酸含量可有效提高大豆的营养利用率。本文根据大豆密码子使用偏好性,对无花果曲霉植酸酶phyA基因进行密码子优化,人工合成了适合在大豆中表达的phyA(b)基因。以p CAMBIA3301为骨架,构建由大豆凝集素基因启动子和信号肽序列调控的植物表达载体pCBPS-phyA(b)。用农杆菌介导法遗传转化吉林35大豆子叶节。PCR检测表明目的基因已初步整合至大豆基因组中;bar试纸条表明所有阳性植株中均能检测到bar基因的蛋白产物;除草剂叶片涂抹显示野生型的叶片出现黄化或枯萎现象,而转基因植株叶片表现正常,具除草剂抗性;以半定量RT-PCR共筛选到13株转phyA和19株转phyA(b)阳性转基因大豆植株。通过对转基因大豆T_3种子中植酸酶活性、无机磷和植酸磷含量等检测,证明人工基因phyA(b)比phyA在大豆种子中所表达的植酸酶具有更高的活性,说明密码子优化有利于提高外源基因的表达。

转phyA基因棉花纯合株系筛选及其对土壤有机磷的利用能力

为了获得转植酸酶基因(phyA)棉花高代纯合株系并验证其利用土壤中有机态磷的能力,对实验室获得的转phyA基因T4代材料进行了PCR筛选,在水培条件下研究了纯合株系植株根际分泌的植酸酶活性,并在田间进行了植株磷含量和棉花产量性状分析。结果表明,在PCR筛选的4个株系中,有2个株系为纯合株系,其后代均为PCR阳性植株。在以植酸盐为唯一磷源条件下,高表达phyA的转基因株系的植酸酶活性较野生型增加了1.5倍,不同生育时期转基因株系植株叶片磷含量中L6株系增加最多,苗期、现蕾期、花铃期和吐絮期分别增加了4.5%,5.95%,5.45%和8.73%。

植酸酶基因PhyA对陆地棉产量性状的影响

在人工控制(培养基、水培、沙培)条件下,植酸酶基因PhyA具有分解利用培养基质植酸磷、提高磷素利用效率的功能,但在田间的表现目前尚未明确。在前期完成的PhyA转基因陆地棉新材料盆栽试验基础上,将其种植在田间条件下,研究PhyA基因对棉花产量性状的影响。结果表明,部分转基因棉花新材料的单株结铃数、铃重、衣分、籽棉产量、皮棉产量与野生型对照存在显著差异,PhyA在田间条件下具有改良转基因棉花部分产量性状的能力。在此基础上,遴选出2个转PhyA棉花优良新品系G3、G2,可用作今后转植酸酶基因棉花新品种培育的基础材料。

野生种马铃薯PHYA基因cDNA的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从野生种马铃薯(SolanumpinnatisectumDun.)中克隆到1个光敏色素基因PHYA,其cDNA全长为3466bp,含有一个3372bp的完整开放阅读框,编码一条长1123个氨基酸的蛋白,分子量为125kDa,等电点为5.8。该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草基因编码的氨基酸序列同源性分别为96%、94%和91%。半定量RT-PCR分析表明,PHYA在根、茎和芽中的表达量较高;光对PHYA表达的作用在地上部器官中表现为抑制,而在地下部器官中则促进。

phyA基因新型载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

利用自行筛选、鉴定的黑曲霉F246,根据植酸酶基因(phyA)成熟肽编码序列设计引物,直接PCR扩增phyA,经酶切分析、DNA测序和氨基酸序列分析证实phyA基因克隆成功。从pMD18T-phyA克隆中获得phyA编码序列,将其与pET30a+质粒连接,构建pET30a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组质粒经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为50kDa,此重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的36.62％,酶活性较天然植酸酶高8倍以上。因此,该phyA基因具有正常的生物学功能,对其进行深入研究,为大量获得高活性植酸酶以及开发新型微生态制剂奠定了基础。

植酸酶phyA^m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyAm重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30bFphyAm为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyAe(在植酸酶基因C端增加了来源于pET30bFphyAm载体上13氨基酸残基)。含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAe在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PPNPe与野生型酶PPNPm8相比:PPNPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。