基于PI3K/AKT信号通路及自噬探讨恒清Ⅰ号方治疗血管性痴呆的作用机制

目的基于PI3K/AKT信号通路及自噬研究恒清Ⅰ号方治疗血管性痴呆的作用机制。方法将60只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、恒清Ⅰ号方低剂量组、恒清Ⅰ号方中剂量组、恒清Ⅰ号方高剂量组和欧来宁组,每组10只。除假手术组外,其余组均采用双侧颈总动脉永久性结扎法建模。术后7 d,恒清Ⅰ号方低、中、高剂量组分别给予0.268 g/mL、0.535 g/mL、1.070 g/mL的恒清Ⅰ号方灌胃,欧来宁组给予欧来宁14.8 g/kg灌胃,假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃,均2次/d,持续灌胃30 d。灌胃结束后采用Morris水迷宫实验测试各组大鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数,以ELISA法检测海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)含量,以Western blot法检测海马组织中PI3K、AKT、p-AKT、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白表达情况。结果水迷宫实验第1~4天,模型组大鼠逃避潜伏期均明显长于假手术组(P均<0.05);恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠逃避潜伏期均明显短于模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组(P均<0.05),且恒清Ⅰ号方高剂量组明显短于恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组(P均<0.05);模型组大鼠穿越平台次数明显少于假手术组(P<0.05),恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠穿越平台次数均明显多于模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组(P均<0.05),且恒清Ⅰ号方高剂量组明显多于恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组(P均<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显增高(P均<0.05),PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显降低(P均<0.05);与模型组和恒清Ⅰ号方低剂量组比较,恒清Ⅰ号方中、高剂量组和欧来宁组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低(P均<0.05),PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显升高(P均<0.05);与恒清Ⅰ号方中剂量组和欧来宁组比较,恒清Ⅰ号方高剂量组大鼠海马组织中TNF-α、NF-κB含量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低(P均<0.05),PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量均明显升高(P均<0.05)。结论恒清Ⅰ号方可以呈量效关系改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,且高剂量恒清Ⅰ号方的作用优于欧来宁,可能与其抑制炎症反应、阻滞细胞自噬和调控PI3K/AKT信号通路有关。

体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。

不同时期朱琏兴奋Ⅰ型针法对糖尿病神经源性膀胱大鼠ROCK、PI3K/AKT通路的影响

目的 观察不同时期朱琏兴奋Ⅰ型针法对糖尿病神经源性膀胱(DNB)大鼠Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)、磷脂酰激酶3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的影响,探讨该针法治疗DNB的机制。方法 将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、针法预防组、针法治疗组、针法预防+治疗组各10只。腹腔注射链脲佐菌素制备DNB大鼠模型。朱琏针法选取大鼠“中极”“三阴交”“列缺”“太冲”穴,针法预防组于6~9 w每日捆绑行针法、针法治疗组于10~13 w每日捆绑行针法,针法预防+治疗组于6~13 w每日捆绑行针法,各组无针法干预需要时每日常规捆绑。比较各组膀胱最大容量、残余尿量、膀胱湿重;苏木素-伊红染色观察膀胱组织形态;Western印迹检测PI3K、AKT蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定ROCK1、ROCK2、P-PI3K、P-AKT蛋白表达;实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)检测ROCK1、ROCK2、PI3K、AKT mRNA表达。结果 与对照组比较,模型组、针法预防组、针法治疗组、针法预防+治疗组膀胱最大容量、残余尿量、膀胱湿重增加,ROCK蛋白和mRNA表达升高,PI3K/AKT蛋白和mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,针法治疗组、针法预防组、针法预防+治疗组膀胱最大容量、残余尿量、膀胱湿重降低,ROCK蛋白和mRNA表达降低,PI3K/AKT蛋白和mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);针法治疗组、针法预防组、针法预防+治疗组膀胱最大容量、残余尿量无统计学差异(P>0.05),膀胱湿重依次降低,ROCK蛋白和mRNA表达依次降低,PI3K/AKT蛋白和mRNA表达依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 朱琏兴奋Ⅰ型针法有利于改善大鼠膀胱功能,其机制可能与其下调DNB大鼠膀胱组织中ROCK表达量、上调PI3K/AKT通路表达量有关,而预防性干预的效果要优于发作后干预,预防、治疗联合干预优于单纯预防性干预或发作后干预。

化纤散结复方颗粒通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路改善大鼠矽肺纤维化

目的研究化纤散结复方颗粒改善大鼠矽肺纤维化的作用及其机制。方法将无特定病原体级雄性SD大鼠随机分为对照组、矽肺模型组和干预组,每组6只。采用一次性呼吸机联合非暴露式气管内滴注法,矽肺模型组和干预组大鼠均予1.0 mL质量浓度为50.0 g/L的二氧化硅悬浊液建立染矽尘大鼠模型,对照组大鼠予等体积0.9%氯化钠溶液。染尘24 h后,干预组大鼠予剂量为10 mL/kg体质量的化纤散结复方颗粒混悬液(质量浓度为212.5 g/L)灌胃,对照组和矽肺模型组大鼠均予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,每日1次。分别于染尘后第14和28天处死各组大鼠3只,进行肺组织病理学检查;以酶联免疫吸附实验检测大鼠血清和肺组织中白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,以蛋白质印迹法检查肺组织中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、核转录因子-κB(NF-κB)和Ⅰ型胶原(COLⅠ)蛋白相对表达水平。结果肺组织病理学检查结果显示,与同时间点矽肺模型组比较,干预组大鼠肺组织炎症反应、纤维结节、胶原纤维均明显减少,纤维化明显减轻。矽肺模型组大鼠第14和28天血清中IL-6和肺组织中IL-6、TGF-β1的水平均高于同时间点对照组(P值均<0.05),且第28天的上述指标均高于第14天(P值均<0.05)。矽肺模型组大鼠血清中TGF-β1水平和肺组织中PI3K、AKT、NF-κB、COLⅠ蛋白相对表达水平均高于对照组(P值均<0.05)。干预组大鼠第14和28天血清中IL-6和肺组织中IL-6、TGF-β1的水平均低于同时间点矽肺模型组(P值均<0.05);且干预组大鼠血清中TGF-β1水平和肺组织中PI3K、AKT、NF-κB、COLⅠ蛋白相对表达水平均高于对照组(P值均<0.05)。结论化纤散结复方颗粒可通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路延缓和拮抗矽肺大鼠肺纤维化。