HSYA与芍药苷联用对脑缺血再灌注损伤大鼠PI3K、Akt mRNA表达的影响

目的:探讨羟基红花黄色素A(HSYA)与芍药苷联合用药对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt mRNA表达的影响。方法:SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为6组,每组10只,分别为模型组、假手术组、HSYA组、芍药苷组、银杏内酯组、合用组。复制脑缺血再灌注模型。脑缺血1 h再灌注6 h后尾静脉注射相应的药物7天,每天1次。HSYA组灌胃HSYA溶液5.0 mg/(kg·d);芍药苷组灌胃芍药苷溶液5.0 mg/(kg·d);合用组是HSYA与芍药苷联合用药,灌胃HSYA溶液和芍药苷溶液各5.0 mg/(kg·d);银杏内酯组灌胃银杏内酯注射液5.0 mg/(kg·d);模型组和假手术组灌胃等量生理盐水。末次给药2 h后采集相应标本保存,qRT-PCR法检测大鼠海马组织PI3K、Akt mRNA的表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠PI3K mRNA表达量显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,HSYA组、芍药苷组、合用组、银杏内酯组大鼠海马组织中PI3K mRNA的表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与合用组比较,HSYA组、银杏内酯组大鼠PI3K mRNA的表达量较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:HSYA与芍药苷联合用药对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护机制可能与显著调节PI3K/Akt信号通路中PI3K mRNA过表达,微调Akt mRNA过表达有关。

ALI时MicroRNA-21通过PTEN调控PI3KAKT途径影响MSC存活的研究

目的观察急性肺损伤(acute lung injury,ALI)时miRNA-21通过磷酸酯酶一张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)调控PI13K/AKT信号通路途径影响间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)存活情况。方法选择体外通过H2O2/SD刺激MSC,观察MSC凋亡和增殖情况,然后通过转染上调和下调MSC的miR-21表达,观察miR-21靶基因PTEN及信号通路分子PI3K/Akt、Bcl-2表达的改变,以及对MSC凋亡和增殖的影响,明确miR-21对ALI时MSC凋亡和增殖的调节及其作用机制;将转染后高表达miR-21的MSC注入LPS诱导的ALI小鼠体内,观察转染后的MSC在体内凋亡及增殖,miR-21靶基因及相关信号通路分子表达的改变,及修复肺损伤和保护肺功能的作用。结果 ALI组、MSC处理组的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表达高于空白对照组,差异具有统计学意义(P <0.05);MSC处理组的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表达低于ALI组,差异具有统计学意义(P <0.05);LY294002处理的miR-21-MSC标记细胞、沉默PTEN的miR-21-MSC标记细胞的MSC存留率、MSC移植后细胞存活率高于miR-21-MSC、野生型MSC细胞,肺湿/干重比低于miR-21-MSC、野生型MSC细胞,差异具有统计学意义(P <0.05)。结论探讨ALI时调节MSC凋亡、增殖相关的miRNAs及其作用机制有助于为增加移植后的细胞存活率找到新的治疗靶点。

PI3K／AKT／GSK-3β信号通路在转录后水平调控ICAM-1的表达

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶（PBK）／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）／糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信号通路调控脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及其机制。方法①LPS（10mg／L）刺激HUVEC0、6、12、24h或者0、4、8、12h或者0、30、60、120min后，Western blot检测ICAM-1、PI3K、P—PI3K、AKT、P—AKT、GSK-3β和P—GSK-3β的表达，实时荧光定量PCR（qPCR）检测ICAM-1 mRNA的表达。②将P13K、AKT和GSK-3B的siRNA分别转染HUVEC，转染浓度梯度为40、80和100nmol／L，对照组转染control siRNA，Western blot检测P13K、AKT和GSK-3①总蛋白的表达。③将PI3K、AKT和GSK-3β的siRNA分别转染HUVEC，对照组转染control siRNA，LPS刺激细胞30min、1h、8h和12h，Westernblot检测P—AKT、P—GSK-3B和ICAM-1的表达，qPCR检测ICAM-1mRNA的表达。④转染方法同上，LPS刺激HUVEC8h后加入放线菌素D（ActD）5ms／L抑制转录，于0、1、2、5和4h收集细胞，qPCR检测ICAM—lmRNA的表达并计算mRNA的半衰期。结果①LPS刺激HUVEC后ICAM-1的表达12h达高峰，与其他时间点有显著差异（P〈0．05或P〈0．01）；LPS刺激HUVEC后ICAM-1mRNA的表达8h达高峰，与其他时间点有显著差异（P〈0．05或P〈0．01）；LPS刺激HUVEC后PI3K、AKT和GSK-3B蛋白的磷酸化水平分别在刺激30min、1h和1h后达高峰。②PI3K、AKT和GSK-3B转染组的最适转染浓度为100nmol／L。③PI3K转染组的P—AKT和P—GSK-3β表达显著下降（P〈0．01），AKT转染组P—GSK-3β表达显著下降（P〈0．01）；PBK和AKT转染组的ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著升高（P〈0．05或P〈0．01），相反GSK-3β转染组ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著下降（P〈0．01）。④PI3K、AKT的沉默表达显著延长ICAM-1的mRNA半衰期（P〈0．01），相反GSK-3B的沉默表达显著缩短ICAM-1的mRNA半衰期（P〈0．01）。结论LPS通过激活PI3K／AKT／GSK-3β信号通路负向调控HUVEC表达ICAM-1。PBK、AKT和GSK-3B在转录后水平调控ICAM-1mRNA的稳定性。

泛素特异性蛋白酶21对胆管癌细胞增殖及迁移的影响及机制

目的:探究泛素特异性蛋白酶21(USP21)在胆管癌(CCA)中的表达及其对CCA细胞增殖与迁移的作用及其机制。方法:通过生物信息学方法和免疫组化及WB法检测CCA组织及细胞中USP21的表达情况。利用体外克隆形成、EdU及Transwell实验检测敲低USP21对CCA细胞QBC939和RBE增殖及迁移的影响。通过RNA测序、质谱、免疫共沉淀(Co-IP)及WB法探究USP21的促癌机制。结果:TCGA等数据库分析结果显示,USP21 mRNA在CCA组织中呈高表达(均P<0.05)。USP21蛋白在CCA组织和细胞中呈高表达(P<0.05或P<0.001或P<0.0001)。敲低USP21后,QBC939和RBE细胞的增殖和迁移能力均显著降低(P<0.01或P<0.001)。RNA测序结果表明,敲低USP21可以通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制CCA细胞的增殖和迁移能力(P<0.05)。质谱鉴定发现,USP21与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)相结合。Co-IP和WB实验结果表明,USP21与IGF2BP1结合并通过泛素化途径调控IGF2BP1的蛋白表达(P<0.001或P<0.0001)。结论:USP21在CCA组织和细胞中均呈高表达,其通过IGF2BP1/PI3K/AKT信号通路增强CCA细胞的增殖及迁移能力。

黄芪皂苷对化疗贫血小鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路相关基因mRNA表达的影响

探讨黄芪皂苷对化疗贫血小鼠PI3K/Akt/mTOR相关基因mRNA表达的影响。选取6~7周龄BALB/c小鼠48只,雄性,随机分为空白组、模型组、皂苷组、甲苷组,每组12只。采用环磷酰胺建立化疗贫血模型,灌胃治疗14 d后,摘眼球取血,QPCR法检测脾脏中Akt,PI3K,BCL-xl,bad,Fox O,mTOR,PTEN的mRNA水平。结果表明,模型组血红细胞计数,血红蛋白含量与空白组、皂苷组和甲苷组比较,明显降低（P〈0.05）。与空白组、皂苷组、甲苷组相比,模型组Akt,PI3K,BCL-xl,bad,mTOR水平明显降低（P〈0.05或P〈0.01）;皂苷组这5种基因水平均较空白组无明显差别;除PI3K外的4种基因,甲苷组较空白组有明显差别（P〈0.05或P〈0.01）;而皂苷组与甲苷组水平也有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。模型组与空白组、皂苷组相比,Fox O,PTEN水平明显升高（P〈0.05或P〈0.01）,较甲苷组无明显差异;甲苷组这2种基因水平均较空白组升高显著（P〈0.05）;而皂苷组的Fox O高于空白组（P〈0.05）,皂苷组的PTEN与空白组无明显差异;皂苷组Fox O,PTEN水平与甲苷组无统计学意义。因此,该研究结果显示黄芪皂苷能提高Akt,PI3K,BCL-xl,bad,mTOR水平（P〈0.01）,降低Fox O,PTEN水平（P〈0.05）。黄芪皂苷可有效改善环磷酰胺所造成的贫血,其机制可能与影响PI3K/Akt/mTOR信号通路相关基因有关。

抗纤灵水煎剂对慢性肾衰模型小鼠PI3K-AKT-mTOR mRNA表达的影响

目的:探讨不同剂量的抗纤灵水煎剂对慢性肾衰模型小鼠磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸及苏氨酸蛋白激酶(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)mRNA表达的影响,并探讨其作用机制。方法:C57BL/6J小鼠50只采用5/6肾切除制备慢性肾脏纤维化小鼠模型,同时设立假手术组10只,造模成功的小鼠随机分为模型组,雷帕霉素组(0.8 mg·kg^(-1)),抗纤灵水煎液低、中、高剂量组(10,20,40 g·kg^(-1)),连续ig 8周后处死小鼠,苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理改变,实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)检测PI3K-AKT-m TOR mRNA表达的含量。结果:与假手术组比较,模型组小鼠肾组织纤维化组织增多,肾损伤评分明显升高,PI3K-AKT-m TOR mRNA表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,雷帕霉素组和抗纤灵各剂量组肾组织纤维化减轻,PI3K-AKT-m TOR mRNA表达明显下降(P<0.05,P<0.01);与雷帕霉素组比较,抗纤灵水煎液中、高剂量与雷帕霉素组间无显著性差异,低剂量组疗效差于雷帕霉素(P<0.05),高、中、低剂量组比较,低剂量组与高、中剂量组之间有明显差异(P<0.05),高、中剂量组之间无显著性差异。结论:抗纤灵水煎液可降模型小鼠表达PI3K-AKT-m TOR mRNA的表达,减轻肾脏纤维化纤维化,抗纤灵水煎液中、高剂量与和雷帕霉素等同。

基于mRNA测序筛选氟暴露大鼠主动脉组织PI3K/Akt/eNOS的基因表达差异

目的探索氟暴露对大鼠主动脉组织磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)基因表达的影响, 为地方性氟中毒致心血管系统损伤的机制研究提供理论基础。方法将40只雄性Wistar大鼠按体质量(80 ~ 100 g)采用随机数字表法分成4组, 每组10只, 分别为对照组(饮用蒸馏水), 低、中、高剂量组[饮用含50、100、150 mg/L氟化钠(NaF)蒸馏水], 大鼠自由饮水摄食, 喂养90 d后处死, 取主动脉组织。对照组、高剂量组各取3份主动脉组织样本进行mRNA测序, 筛选差异基因, 并对差异基因进行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析。同时, 采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠主动脉组织PI3K、Akt、eNOS mRNA表达水平。结果高剂量组与对照组相比, 差异基因有756个, 其中上调基因有654个, 下调基因有102个。这些差异基因主要与肌肉收缩、肌肉调节、肌肉组织发育、横纹肌细胞发育、肌细胞分化、血液循环调节和横纹肌组织发育等生物过程相关, 主要富集于环磷酸鸟苷(cGMP-PKG)信号通路、松弛素信号通路、PI3K/Akt信号通路等。与对照组相比, 低、中、高剂量组大鼠主动脉组织PI3K、eNOS mRNA表达水平均较低(P均<0.05);低剂量组Akt mRNA表达水平较高(P<0.05)。结论氟暴露对大鼠主动脉组织的功能发挥和基因表达等生物过程具有一定的影响, PI3K/Akt/eNOS信号通路可能在氟致大鼠主动脉组织损伤过程中发挥重要作用。

海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠PI3K/Akt通路相关基因表达的影响

目的:探讨海藻、生甘草剂量为2015年版《中华人民共和国药典》规定高限剂量的2倍条件下,海藻玉壶汤加减海藻甘草反药组合对甲状腺肿大大鼠PI3K/Akt通路相关基因表达的影响。方法:84只大鼠按体质量分为空白组、模型组、阳性药组、全方组、去海藻组、去甘草组、去藻草组,每组12只。用丙硫氧嘧啶复制甲状腺肿大动物模型,然后给予相应药液灌胃治疗。采用TUNEL检测细胞凋亡,计算凋亡指数,采用实时定量PCR和Western Blot检测PI3K、Akt、Cyclin D1、Bcl-2 mRNA和Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果:与模型组比较,全方组凋亡指数显著升高(P<0.05),各中药给药组PI3K、Cyclin D1和Bcl-2 mRNA表达水平显著降低(P<0.01,P<0.05),全方组和去藻草组Akt mRNA表达显著降低(P<0.05),各中药给药组p-Akt、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论:海藻玉壶汤加减海藻甘草对丙硫氧嘧啶所致甲状腺肿大大鼠有显著治疗作用,通过作用于PI3K/Akt信号通路,下调Cyclin D1和Bcl-2等mRNA的表达,对细胞增殖和细胞凋亡两方面进行调控,起到治疗甲状腺肿大的作用。

胰岛素的抗炎作用及其机制的研究

目的观察不同浓度胰岛素干预对脂多糖刺激的单个核细胞核因子抑制蛋白(IκB)、核转录因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的影响,同时在细胞水平对PI3K/Akt信号通路上关键分子P-Akt进行监测,探讨胰岛素的抗炎作用及可能机制。方法收集30例T2DM患者外周血各10ml,密度梯度法分离单核细胞,随机分5组进行干预培养,对照(Con)组、低浓度胰岛素100mU/L(L-Ins)组、低浓度胰岛素联合LY-294002 10μmol/L(L-Ins+LY)组、高浓度胰岛素1000mU/L(H-Ins)组、高浓度胰岛素联合LY-294002 10μmol/L(H-Ins+LY)组,每组设两个亚组。24h后加脂多糖100ng/ml继续培养,其中一个亚组采用Western blot测定P-Akt、IκBα、NF-κB蛋白的表达情况,另一亚组采用RT-PCR检测TNF-αmRNA水平。结果 L-Ins组、H-Ins组与Con组比较,P-Akt、IκB含量增加,NF-κB、TNF-αmRNA水平下降(P<0.05);H-Ins组较L-Ins组作用更明显(P<0.05);L-Ins组较低浓度L-Ins+LY组、H-Ins组较H-Ins+LY组P-Akt、IκB含量升高,NF-κB、TNF-αmRNA降低(P<0.05);L-Ins+LY组、H-Ins+LY组与Con组P-Akt、IκB、NF-κB比较,差异无统计学意义(P>0.05),TNF-αmRNA水平高(P<0.05),L-Ins+LY组和H-Ins+LY组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论胰岛素有直接抗炎作用,其效应呈剂量相关性;胰岛素可能通过激活PI3K/Akt通路,增加IκB,影响NF-κB的状态,从而对炎性因子合成和分泌进行调节;在PI3K/Akt通路受阻时,胰岛素可能通过其他通路增加炎症因子的合成和分泌。