聚合抗稻瘟病基因Pia和抗白叶枯病基因Xa23的广亲和恢复系选育

为获得抗白叶枯病和稻瘟病的水稻恢复系材料,选择携带抗白叶枯病基因Xa23的抗病品系RF76及携带抗稻瘟病基因Pia的甬优1540(F1)为供体材料,与多个优良杂交水稻恢复系进行多代杂交和回交,在分离群体中利用分子标记辅助选择和田间表型鉴定选择相结合的方法,获得70份农艺性状稳定且导入Pia、Xa23、Pia+Xa23目标基因的水稻恢复系。采用白叶枯病鉴别菌系P6对230份重点株系及其杂交组合进行抗性鉴定,所有材料在孕穗期都表现为抗白叶枯病。稻瘟病抗性鉴定结果表明,含Pia基因的恢复系及其配组的杂交稻组合稻瘟病抗性优于亲本材料RF76,均表现为中抗及以上。以此恢复系配置的杂交组合“华浙优2473”参加浙江省单季籼稻杂交稻区试及生产试验,农艺性状表现良好,2年抗性鉴定结果显示,稻瘟病和白叶枯病抗性均达到中抗以上。试验结果表明,Pia和Xa23的导入,结合连续抗病试验的筛选,获得抗稻瘟病和白叶枯病的恢复系材料,将其用于配组杂交稻组合,在生产中具有良好的应用前景。

巴西苏木素通过抑制SarA以PIA依赖性方式减少MRSA生物膜形成的研究

目的 探究巴西苏木素(brazilin,BN)抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)生物膜形成的机制,为开展中医药防治MRSA感染提供新思路。方法 建立MRSA ATCC43300菌株生物膜模型,试验分为BN 8、16和32μg/mL组及对照组;通过结晶紫法测定BN对MRSA生物膜的抑制作用;刚果红平板法、硫酸-苯酚法检测BN对细胞间多糖黏附素(polysaccharide intercellular adhesion,PIA)合成的影响;使用real-time PCR(qRT-PCR)方法验证胞间黏附素操纵子icaA和icaD转录水平;分析高通量转录组测序可能存在的生物膜抑制基因;通过qRT-PCR、Western blot方法对相关基因及蛋白加以验证;通过皮下埋植静脉导管建立MRSA生物膜感染小鼠模型进一步验证BN疗效。结果 与对照组相比,不同浓度的BN组均能显著减少MRSA生物膜及PIA生成,其中在最低剂量8μg/mL BN作用下,MRSA生物膜形成量下降40.17%(P<0.01)、PIA减少55.56%(P<0.01);通过qRT-PCR验证不同浓度的BN组均能显著抑制icaA和icaD基因的表达,其中在8μg/mL浓度下,icaA和icaD基因的表达量分别比对照组降低了59.03%(P<0.01)、48.33%(P<0.05);高通量测序显示sarA下调-1.458 log2;qRTPCR、Western blot结果显示,BN能显著抑制sarA转录及其蛋白表达;通过体内实验显示,BN能有效抑制小鼠体内MRSA生物膜的形成。结论 BN通过抑制SarA的表达,减少PIA的合成,进而干预生物膜的形成。

氧化苦参碱对脂多糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖p-STAT1/PIAS1信号分子的影响

目的观察氧化苦参碱对LPS诱导下HMC增殖时p-STAT1、PIAS1蛋白和mRNA表达情况,探讨其相互关系。方法体外培养HMC,分为空白对照组和LPS模型组及氧化苦参碱干预组,培养12、24、48 h时以MTT法检测HMC的增殖情况,ELISA检测细胞上清Col-Ⅳ含量,收集同时段细胞,提取细胞裂解蛋白和mRNA,采用Western blot检测p-STAT1和PIAS1的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测STAT1和PIAS1 mRNA表达。结果LPS组细胞增殖较对照组显著加快(P<0.01),Col-Ⅳ的表达显著高于对照组(P<0.01);氧化苦参碱干预后细胞增殖和Col-Ⅳ的表达显著较模型组降低(P<0.01)。蛋白和mRNA表达情况:LPS诱导下各时间段p-STAT1表达升高,表达量显著高于对照组(P<0.01),经OM干预后表达显著下降(P<0.01);LPS诱导下PIAS1表达量显著降低(P<0.01),经OM干预,与LPS组相比各时间段均显著上升(P<0.01)。结论氧化苦参碱对LPS诱导的人系膜细胞增殖过程中p-STAT1/PIAS1蛋白及mRNA表达有调节作用,氧化苦参碱可能影响JAK/STAT信号转导通路。

胶质瘤中STAT3通路及其负调控因子PIAS3活化状态和生物学效应的分析

目的探讨STAT3信号通路及其负调控因子PIAS3在胶质瘤细胞中的活化状态及生物学效应。方法采用免疫组织化学方法检测胶质瘤中p-STAT3及PIAS3的活化状态;STAT3通路抑制剂60μmol/L AG490作用胶质瘤U118、U87细胞24、48 h,MTT法观察U118、U87细胞增殖能力的变化;免疫荧光检测AG490作用前后细胞p-STAT3及PIAS3蛋白表达的变化。结果 pSTAT3及PIAS3在不同级别胶质瘤细胞胞质和胞核内的表达无统计学差异,但在细胞核内p-STAT3和PIAS3的表达呈负相关;AG490处理细胞后,U118细胞数量无明显改变,U87细胞则表现为生长抑制。免疫荧光结果显示,AG490处理后,U118细胞pSTAT3和PIAS3表达水平均无显著改变,U87细胞p-STAT3核内表达下调,PIAS3出现明显核易位。结论 PIAS3通过核易位调控STAT3信号通路的活性,抑制胶质瘤细胞生长。

RNAi抑制PIAS3表达对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建针对PIAS3的RNAi质粒载体,初步探讨抑制PIAS3表达对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建3个RNAi载体,用脂质体法将其转染胶质瘤细胞系CHG-5,通过半定量RT-PCR筛选干扰效率最高的重组RNAi质粒。将该RNAi质粒转染体外培养的人胶质瘤U251细胞株,用半定量RT-PCR和Western blot检测PIAS3的表达。Annexin V2 FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞增殖周期变化。结果:转染干扰质粒的细胞株PIAS3基因和蛋白表达均有减弱。流式细胞仪分析,抑制PIAS3表达能够诱导胶质瘤U251细胞拮抗凋亡(P<0.01),同时出现细胞周期改变,表现为G2期细胞比例升高,S期细胞比例降低,具有显著性差异(P<0.05)。结论:下调PIAS3基因表达使U251阻滞在G2期,拮抗细胞凋亡。

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。

淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因序列分析及原核表达系统的构建

目的:分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列,构建PIA基因的原核表达系统。方法:采用高保真PCR扩增9株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列,T-A克隆测序后与GenBank公布的序列进行同源性比较。构建PIA原核表达系统。采用不同浓度IPTG诱导重组目的蛋白rPIA表达,10%SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rPIA表达情况。采用Ni-NTA亲和层析法提纯rPIA,SDS-PAGE检测提纯效果。结果:与报道的PIA基因序列(GenBankNo:L19962)比较,9株淋病奈瑟菌核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.6%-100%和99.1%-100%,均属于IA6血清型。rPIA表达量可占细菌总蛋白量的50.1%,提纯后仅显示单一的目的蛋白条带。结论:IA6为本地区淋病奈瑟菌优势血清型,该基因序列相当保守。所构建的PIA基因原核表达系统能高效表达rPIA,为今后研制淋病奈瑟菌血清学检测试剂盒及疫苗研制奠定了基础。

Caspase-3体外对PIAS1蛋白酶切作用的初步验证

目的观察凋亡相关蛋白Caspase-3体外对PIAS1蛋白的酶切作用,为后续研究奠定基础。方法以HEK293T细胞表达PIAS1蛋白,采用免疫共沉淀(Co-IP)实验观察其与Caspase-3间的结合作用;采用体外蛋白酶切实验检测Caspase-3对PIAS1的酶切作用。结果 Co-IP实验发现体外Caspase-3可与PIAS1蛋白结合;蛋白酶切实验发现PIAS1的酶切片段。结论 Caspase-3与PIAS1在体外具有相互作用,PIAS1体外可被Caspase-3酶切,为后续研究奠定了基础。

PIAS3在人脑胶质瘤中的表达

目的通过观察PIAS3(protein inhibitor of activated STAT3)在不同级别胶质瘤中的表达,研究PIAS3表达与胶质瘤分化程度的关系。方法运用免疫组织化学法对50例胶质瘤标本及5例正常脑组织中PIAS3的表达进行对照研究。结果正常脑组织中未见PIAS3表达,胶质瘤标本中的总阳性率为56%(28/50),两者之间差异有显著性(P<0·01);不同病理级别的阳性率和标记指数随着肿瘤恶性程度的升高而增加,但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤PIAS3阳性率无明显差异(P>0·05),Ⅰ～Ⅲ级与Ⅳ级阳性率之间有显著差异(P<0·01);Ⅰ级与Ⅱ级的标记指数之间、Ⅲ级与Ⅳ级的标记指数之间均无明显差异(P>0·05),低度恶性组(Ⅰ～Ⅱ级)与高度恶性组(Ⅲ～Ⅳ级)之间有显著差异(P<0·05)。结论PIAS3在胶质瘤中有表达,并与肿瘤的病理分级和恶性程度密切相关,提示其可能参与了胶质瘤的发生、发展。

PIAS2蛋白在不同病理分型的无精子症患者睾丸组织中的表达

目的:探讨PIAS2在不同生精功能状态的人睾丸组织中的表达情况。方法:对80例无精子症患者进行睾丸组织病理检查诊断,根据病理形态的不同分为:生精功能正常或基本正常(n=40)、精子发生低下(n=20)、唯支持细胞综合征(n=20)等。选择上述各型结构完整的睾丸组织,分别应用免疫组化法(SP)对PIAS2在不同生精功能状态的睾丸组织进行研究。结果:PIAS2在各级生精细胞多为强阳性表达,呈深棕黄色;PIAS2在间质细胞及支持细胞表达弱阳性表达或不表达。结论:PIAS2染色强弱与睾丸生精功能的强弱有一定关系,是一个潜在的判断睾丸生精功能的指标。

STAT3和PIAS3在大肠癌演变过程中的表达研究

目的研究STAT3和PIAS3基因在大肠癌演变过程中的表达情况以及两者间的相互联系。方法以30例大肠癌患者、30例腺瘤患者、30例息肉患者为研究对象,大肠癌组织、腺瘤组织为实验组,息肉组织为对照组。应用免疫组化方法检测STAT3和PIAS3蛋白在大肠癌演变过程中的表达。研究结果采用IPP6.0系统测定平均吸光度,进行半定量分析。结果大肠癌组织STAT3及PIAS3蛋白的表达水平远高于腺瘤组织(P<0.05),且腺瘤组织的表达水平均远远高于息肉组织(P<0.05),差异有统计学意义。结论STAT3及PIAS3基因在大肠癌演变过程中表达水平逐次升高,可能提示其对大肠癌的发生发展起着重要的作用。

miR-181a-5p靶向PIAS1对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞损伤的影响

背景急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)引起的急性炎症对人们健康的危害性极大,严重时会危及生命.其发病机制复杂,尚未完全清楚,研究发现miRNA参与了AP的发病过程.研究发现miR-181a-5p可抑制癌细胞迁移、侵袭和血管生成;miR-181a-5p还能抑制胃癌细胞增殖、侵袭,转移和上皮间充质转化.抑制miR-181a-5p表达可通过负向靶向INPP5A抑制细胞增殖和侵袭,增强宫颈癌细胞凋亡.miR-181a可抑制胰腺癌细胞系的生长、减少迁移,增加凋亡.但miR-181a-5p在AP的增殖凋亡中的影响及作用机制尚不清楚.目的研究miR-181a-5p对AP腺泡细胞损伤的影响及潜在的作用机制.方法用100 nmol/L的雨蛙肽处理大鼠胰腺腺泡AR42J和MPC-83构建AP模型,设置Con组、Caerulein组、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-181a-5p组(转染miR-181a-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染antimiR-NC)、anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p)、Caerulein+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p后进行Caerulein处)、Caerulein+pcDNA组(转染pcDNA后进行Caerulein处理)、Caerulein+pcDNA-PIAS1组(转染pcDNA-PIAS1后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC组(anti-miR-181a-5p和si-NC共转染后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1组(anti-miR-181a-5p和si-PIAS1共转染后进行Caerulein处理),用脂质体法转染至AR42J和MPC-83细胞.酶联免疫吸附试验法检测雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的TNF-α和IL-6的表达;qRT-PCR检测AR42J和MPC-83细胞中miR-181a-5p、PIAS1 mRNA的表达水平;Western Blot检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性.结果雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞后,TNF-α和IL-6的表达显著升高;miR-181a-5p的表达水平显著升高;PIAS1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低.miR-181a-5p抑制表达和PIAS1过表达抑制TNF-α和IL-6的表达,抑制细胞凋亡.miR-181a-5p靶向负调控PIAS1;抑制PIAS1表达逆转了抑制miR-181a-5p对雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的凋亡抑制作用.结论抑制miR-181a-5p表达可以抑制雨蛙肽诱导的AP腺泡细胞损伤,其机制可能与靶向调控PIAS1有关.可为AP诊断和治疗提供新靶点和新思路.

miR-375调控PIAS1对急性胰腺炎腺泡细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨微小RNA-375(miR-375)对急性胰腺炎(AP)腺泡细胞增殖及凋亡的影响及其对信号转导和转录激活子1的活化抑制蛋白(PIAS1)的调控作用。方法用雨蛙素(CAE)处理胰腺腺泡细胞株(AR42J细胞)构建AP模型,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)与Western印迹分别检测miR-375与PIAS1的表达。利用脂质体转染技术分别将anti-miR-NC、anti-miR-375、si-NC、si-PIAS1转染至AR42J细胞,同时将anti-miR-375与si-NC、si-PIAS1分别共转染至AR42J细胞后加入CAE处理细胞。噻唑蓝(MTT)实验与流式细胞仪分别检测AR42J细胞增殖及凋亡。双荧光素酶报告基因实验检测miR-375对PIAS1的靶向作用。Western印迹检测CyclinD1、P21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达。结果CAE处理后AR42J细胞中miR-375的表达升高,而PIAS1的表达降低;双荧光素酶报告基因实验证实PIAS1是miR-375的直接靶点;转染anti-miR-375后,由CAE诱导的AR42J细胞凋亡明显受到抑制,而细胞增殖能力明显增强,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达上调,P21、Bax蛋白表达下调(均P<0.05);共转染si-PIAS1后,明显促进CAE诱导的AR42J细胞凋亡,而抑制细胞增殖,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达下调,P21、Bax蛋白表达上调(均P<0.05)。结论miR-375在AP腺泡细胞中高表达,而PIAS1低表达,沉默miR-375可通过上调PIAS1表达而抑制腺泡细胞凋亡并促进细胞增殖进而减缓AP发展进程。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因原核表达系统的构建及序列分析

目的：分析比较5株临床分离的淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列，构建PIA基因的原核表达系统。方法：采用高保真PCR扩增5株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列，T—A克隆后测序并与已发表的序列进行比较，用Wonderful分子生物学软件分析基因和蛋白质序列的相似性。再构建PIA原核表达系统，不同浓度IPTG诱导后，10％SDS—PAGE检测蛋白表达情况。结果：5株PIA淋病奈瑟菌均为IA6血清型。与报道的PIA基因序列（No：L19962）比较，核苷酸和氨基酸序列相似性均分别高达99．47％-100％和99．04％-100％。构建的原核表达系统pET42-PIA—Ecoli BL21DE3表达的重组蛋白PIA量占细菌总蛋白量的49．6％。结论：IA6为PIA菌株优势血清型，核苷酸和氨基酸序列相似性高，已成功构建淋病奈瑟菌PIA基因高效原核表达系统，为淋病奈瑟菌基因疫苗和临床检测试剂盒的研制打下基础。

PIAS3的表达与人脑胶质瘤恶性程度的关系

目的探讨PIAS3表达与胶质瘤分化程度的关系。方法收集病理确诊的30例不同恶性程度胶质瘤以及5例正常脑组织手术标本,采用光镜、免疫组化方法检测PIAS3表达水平;提取总微小RNA,应用实时荧光定量PCR技术验证PIAS3在人不同级别脑胶质瘤组织和正常脑组织中的表达,进行比较对照研究。结果 PIAS3在正常脑组织中高表达,在人脑胶质瘤中表达均明显降低,两者之间存在显著性差异(P<0.01)。PIAS3人脑胶质瘤中表达水平呈随胶质瘤级别Ⅰ级,Ⅲ级和Ⅳ级(实体)组织增高而降低趋势,但在Ⅳ级(瘤中心坏死)组织中表达无明显下降,部分甚至高于正常脑组织中表达(P<0.05)。PIAS3在胶质瘤级Ⅱ级和Ⅲ级,Ⅲ级和Ⅳ级(实体)组织中的表达均有明显差异(P<0.01)。结论 PIAS3在胶质瘤组织中低表达并与胶质瘤级别呈负相关,提示其与胶质瘤的发生、发展密切相关。

山回波的PIA因子在3cm雷达波衰减订正中的应用

通过比较同一山体在晴雨两种天气条件下的回波反射率 ,确定在雷达与山体之间的降水造成山体回波的路径积分衰减因子 ( path- integrated attenuation factor) ,以此计算雷达与山体之间降水的真实反射率 ,从而把降水对 X( 3cm波长 )波段雷达波的衰减订正掉。

PIAS-NY酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活活性分析

目的构建PIAS-NY(protein inhibitor of activated STAT-NY,PIAS-NY)的诱饵载体,为应用酵母双杂交系统筛选与PIAS-NY相互作用的蛋白建立实验基础。方法应用PCR法扩增PIAS-NY编码序列的片段,先将其克隆入pGEMT-easy内,经序列测定确认无误后,再将片段亚克隆入pGBKT7载体内,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PIAS-NY转化到酵母细胞AH109及Y187中,进行诱饵载体的毒性及自激活活性分析。结果构建了PIAS-NY的诱饵载体,经过自激活活性的分析发现,该诱饵载体没有自激活活性,同时对两种酵母细胞的生长无毒性作用。结论成功构建了PIAS-NY的酵母双杂交诱饵表达载体,为进一步筛选与之相互作用的蛋白提供了实验基础。

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的:构建PIAS3(活化型STAT3抑制蛋白)的Myc融合蛋白真核表达重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法:采用PCR方法,扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1851bp的特异性片段连接到T载体上,将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果:重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4357和1318bp2条带,XbaⅠ酶切鉴定时有3291bp和2384bp2条带,与预期结果一致。测序结果显示,13个氨基酸Myc在N端,然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达,在相对分子质量68000处检测到特异的蛋白表达条带。结论:成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。

离子交换树脂法去除PIA废水中Co^(2+)、Mn^(2+)的研究

研究了D001、D113、116三种离子交换树脂法去除精间苯二甲酸(PIA)废水中的Co2+、Mn2+时的交换性能和再生性能,结果表明:三种树脂均可有效去除废水中的Co2+、Mn2+,相同体积的湿树脂交换Co2+、Mn2+总量大小为D113>116>D001,再生后交换性能可恢复。

淋球菌孔蛋白PIB和PIA融合蛋白真核表达载体构建及体内表达

目的克隆淋球菌孔蛋白PIB和PIA基因并构建融合蛋白真核表达质粒pCI-PIB-PIA,了解pCI-PIB-PIA能否被小鼠骨骼肌细胞摄取并表达。方法采用PCR方法从质粒pET-PIB和pET-PIA中获得孔蛋白PIB和PIA全长DNA片段,构建表达融合蛋白PIB和PIA的真核表达载体pCI-PIB-PIA。pCI-PIB-PIA肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ABC法检测pCI-PIB-PIA免疫小鼠肌细胞中PIB-PIA融合蛋白的表达。结果PCR可扩增出预期大小的全长PIB和PIA基因片段。与GenBank报道的PIB和PIA序列比较,重组质粒pCI-PIB-PIA中目的插入片段的核苷酸序列同源性达到99%以上。免疫小鼠的肌细胞能摄取pCI-PIB-PIA并表达PIB-PIA融合蛋白。结论本研究成功地构建了淋球菌孔蛋白PIB和PIA基因重组真核表达载体pCI-PIB-PIA;pCI-PIB-PIA接种小鼠后可见免疫小鼠肌细胞中PIB-PIA融合蛋白的表达,该结果可作为淋球菌多价DNA疫苗的研究基础。