水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用

【目的】为探索抗稻瘟病Pib基因的分子标记用于水稻抗稻瘟病辅助选育,36个四川地方稻瘟病菌株被用来检测Pib基因的抗性。同时利用检测感病等位基因Pib的显性标记Lys145,并结合前人报道的检测抗病等位基因Pib的显性标记Pibdom组成一套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记。【方法】利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对122个杂交稻亲本或材料进行分子鉴定,并分别采用稻瘟病菌株05-12(ZB13)和05-30(ZC15)单小种接种试验进行致病性测试。【结果】所检测的122个杂交稻亲本或材料中,只有7个杂交稻亲本或材料含抗病基因Pib,且对稻瘟病菌菌株ZB13和ZC15表现抗病反应。此外,利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对600个杂交F2代单株进行早期筛选,得到185个抗病基因Pib纯合的单株,田间抗性调查结果与抗病基因分子检测结果一致。【结论】该套显性分子标记可应用于水稻抗稻瘟病基因Pib的分子标记辅助选育。

聚合稻瘟病抗性基因Pizt和Pib培育江苏粳稻稻瘟病抗性新品种

稻瘟病是对水稻生产具严重威胁的真菌病害,培育聚合多个抗稻瘟病基因的抗病品种是防控该病最为经济有效的途径。以优质、高产、感稻瘟病的中间材料L0为受体亲本,与携带Pizt和Pib基因的粳稻品种武运粳21号杂交,经分子标记及系谱选择、抗性鉴定和农艺性状鉴定,获得6个不同类型的稳定株系。苗瘟及穗瘟抗性鉴定表明,含不同基因组合的抗性效应存在显著差异,其中携带Pizt/Pib的L5株系抗性频率与武运粳21号相当,显著高于仅携带Pizt或Pib的株系。将L5株系参加江苏省中熟中粳淮南迟播组中间试验,最后审定定名为扬粳3491。该结果表明利用粳稻中广泛分布的广谱抗病基因Pizt,再聚合其他染色体位点的抗性基因,可有效地提高江苏粳稻品种的稻瘟病抗性。这一研究还表明利用分子标记选择可快速实现多个抗病基因的聚合,有效缩短水稻抗病育种进程。

云南元江普通野生稻中Pi-ta和Pib同源基因的克隆和分析

用高保真PCR技术从云南元江普通野生稻中克隆了抗稻瘟病Pi-ta同源基因的编码区及Pib基因的部分同源序列。Pi-ta同源基因的编码区序列与报道的栽培稻有99.7%的同源性。根据前人的结果,从元江普通野生稻的Pi-ta基因推导的氨基酸序列中918位点为丝氨酸,属于Pi-ta^-等位基因,不能对含有AVRPita基因的稻瘟病菌产生抗性。与Pi-ta基因相比,元江普通野生稻中的Pib同源基因第一外显子与栽培稻的相应序列间存在较大差异,其中有一段87 bp的DNA序列缺失,而且不能按正常的Pib基因序列的阅读框进行翻译。因此认为,元江普通野生稻不具有基于Pi-ta和Pib基因的抗稻瘟病遗传基础。

PIB基因点突变与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药相关性的研究

目的：了解浙江地区分离的淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素的耐药率及该菌PIB基因G120和A121点突变与青霉素和四环素耐药性的关系。方法：采用高保真PCR扩增25株淋病奈瑟菌PIB基因序列，T-A克隆后测序。分析测序菌株PIB基因中与耐药性密切相关的G120和A121变异情况，采用二倍琼脂稀释法确定PIB菌株的耐药性。结果：25株淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素均耐药，耐药率为100％。经测序的25株PIB淋病奈瑟菌中，1株（4．0％）G120或A121均未突变，其对青霉素和四环素的MIC分别为8μg／ml和4μg／ml。5株（20．0％）G120D／N突变而A121不变，1株（4．0％）G120不变而A121G突变，2株（8．0％）G120N突变但A121缺失，16株（64．0％）G120K和A121D双位点突变。24株G120和／或A121突变的PIB菌株均对青霉素和四环素的MIC为4～128μg／ml不等。结论：浙江地区分离的PIB型淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药率为100％。上述淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药与PIB基因氨基酸序列G120和／或A121突变密切相关。

不同启动子驱动下Pib基因的表达及与稻瘟病抗性的关系

根据Pib基因的结构特点,分别构建了不同启动子驱动Pib基因ORF的表达载体pNAR701、pNAR704和pNAR705,分别由35S+Pib启动子、35S启动子和Pib启动子驱动;采用农杆菌介导转化水稻品种日本晴。经PCR、Southern blot分析证实了Pib基因已经稳定整合到日本晴的基因组中;Northern blot、实时荧光定量PCR对Pib基因表达分析表明:pNAR701转基因后代株系中目的基因的表达量较pNAR704和pNAR705高,且同一载体的不同转基因后代株系间存在着表达量的差异。对T1、T2代苗期稻瘟病抗性鉴定显示:不同启动子驱动的Pib结构基因mRNA的表达,都表现出对稻瘟菌生理小种ZB1和ZG1的高抗特性,但不同启动子驱动的该基因编码区mRNA的表达与稻瘟病抗性水平间没有明显差异。

抗稻瘟病基因Pib4的转基因研究

[目的]探讨抗稻瘟病基因Pib4的转基因。[方法]利用PCR法克隆Pib基因的NBS功能结构域到双元载体pCAMBIA1301上,以粳稻品种农大18的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,采用农杆菌介导法转化Pib4基因。[结果]经PCR和GUS活性检测表明外源基因已整合到水稻基因组中并获得表达;用稻瘟病菌接种阳性植株,获得了抗稻瘟病菌的水稻植株。[结论]为合理利用抗病基因和育种提供了参考。

Pib基因启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证

用不同长度5′端缺失的Pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株,系统研究了Pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。GUS组织化学分析结果表明,含6个、3个和1个拷贝该分子元件的Pib启动子的转基因水稻愈伤组织在暗处理后均能在X-Gluc溶液中显示不同深浅的GUS蓝色,而6个分子元件全部缺失的启动子片段的转基因愈伤组织不显现GUS蓝色。荧光定量分析结果表明,Pib启动子序列具有很强的器官特异性,即便是长仅222bp、不含YTCANTYY元件的5′端缺失体Pib启动子-gus构建的转基因植株,其根部Pib启动子活性仍高于地上部器官。但其启动活性和暗诱导性都随启动子缺失片段的缩短即该分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明,YTCANTYY在Pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件,它赋予了启动子的暗诱导性,至少在6个拷贝以内,Pib启动子的暗诱导活性与其拷贝数目呈正相关,各个YTCANTYY分子元件的暗诱导活性可能是累加的。

Pib基因编码区功能的转基因初步鉴定

将Pib结构基因克隆到双元载体,构建了3个植物表达载体pNAR501、pNAR502和pNAR503,这3个载体分别携带由35S驱动Pib结构基因的外显子2外显子3、5′端部分缺失外显子1和5′端部分缺失的外显子1外显子2外显子3的不同片段。应用农杆菌介导法获得水稻品种日本晴转基因植株30株,经PCR、Southern b lot和后代潮霉素抗性分离检测确定外源基因已整合进水稻基因组。T0代转基因植株分蘖期大苗离体叶片抗稻瘟病鉴定结果表明,含3个不同载体的转基因植株对稻瘟病E1、F1、G1生理小种的抗性都显著高于对照日本晴。T1代3至4叶期幼苗活体接种鉴定结果与T0代离体叶片鉴定结果不同,对E1、F1、G1生理小种的抗性低于对照日本晴。

35S驱动Pib基因启动区和编码区的转基因初步分析

将包含Pib基因启动区及下游完整编码区的9.9kbDNA片段克隆到双元载体pPZP2Ha3（＋）中,构建了35S驱动的正义表达载体pNAR701（20.3kb）;同时将Pib基因编码区6986～9392bp之间的DNA片段,克隆到双元载体pPZP2Ha3（-）中,构建了35S驱动的反义表达载体pNAR703（12.8kb）;用农杆菌介导法转入中感稻瘟病水稻品种R109中。PCR、Southern blot鉴定以及转基因T0代种子的潮霉素抗性鉴定证明,目的基因已经整合到R109基因组中,并能在后代稳定遗传。Northern blot分析表明含有启动区及下游完整编码的Pib基因片段在35S驱动下能够在转基因后代中表达。对T1代苗期转基因植株和分蘖期离体叶片进行抗稻瘟病初步分析,结果显示pNAR701转基因植株对稻瘟病生理小种ZD1和ZG1的抗性较对照增强,而转反义片段的pNAR703转基因植株对稻瘟病的抗性较对照减弱。

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的检测与分析

【目的】检测黑龙江省稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t在不同地区、年份间流行菌株的分布情况与变异机制,了解其等位基因的致病表型,为黑龙江省抗瘟品种布局提供参考依据。【方法】利用NCBI中公布的无毒基因序列对3个无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的基因全长和编码序列(coding sequence,CDS)分别设计特异性引物,将2016年和2017年采自黑龙江省不同地区335个稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,并挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行致病型测定。【结果】在PCR电泳检测中AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t均出现特异性条带,说明这3个无毒基因在黑龙江省均有分布,并以不同分布频率与突变类型出现。3个无毒基因平均扩增频率分别为75.52%、87.16%和85.67%。其中AVR-Pib通过电泳检测与PCR产物测序检测出4种带型(无带、高带、中高带与低带)和5种变异类型AVR-Pib(1-1、1-2、2、3、3-1),基因型AVR-Pib-1-1、AVR-Pib-1-2、AVR-Pib-2和AVR-Pib-3-1为新发现的变异类型,其中基因型AVR-Pib-1-1和AVR-Pib-1-2均为转座子Pot2的插入,但插入位点不同;基因型AVR-Pib-2在阅读框上游存在小片段的插入;基因型AVR-Pib-3-1碱基序列与原序列比对有4处差异,即32(C/G)35(T/A)36(T/A)38(T/A),导致氨基酸翻译提前终止。对检测到的5种等位基因型进行致病型测定,分析发现除正常基因型AVR-Pib-3外,其他变异基因型无毒功能均已丧失。而AVR-Pik经PCR产物测序检测出7种等位基因型,AVR-Pik(D、A、B、C、E、F、F2),碱基序列的变化均导致氨基酸错义突变,7种等位基因型均已见报道。无毒基因AvrPiz-t通过电泳检测和PCR产物测序分析,发现2种带型(高带和正常带型)与4种基因型AvrPiz-t(A、B、C、D),其中AvrPiz-t-A为正常基因型;基因型AvrPiz-t-B在191位处有碱基A的插入,导致氨基酸翻译提前终止;基因型AvrPiz-t-C为新发现的等位基因型,其特点在于与A类型存在17(T/C)和19位处碱基C的插入,发生移码突变翻译提前终止;高带型对应的无毒基因型AvrPiz-t-D经测序验证为Pot3转座子的插入。4种基因型菌株分别接种水稻单基因系发现,AvrPiz-t-A可以被Piz-t识别表现无毒,AvrPiz-t(B、C、D)均不能被Piz-t所识别而表现为有毒性。【结论】黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t分布较为广泛,且变异类型丰富,研究结果可为选育和推广携带相应抗病基因的水稻品种提供参考。

来自中国云南野生稻的抗稻瘟病遗传资源(英文)

与Pi-ta^-等位基因相比,含有Pi-ta^+等位基因的栽培稻具有抗稻瘟病特性。本研究用基因序列分析的方法检测了来自云南的不同栽培稻品种以及不同类型和来源的普通野生稻种和非洲长雄蕊野生稻种中的Pi-ta基因,发现Pi-ta基因在稻属植物中高度保守,但Pi-ta^+等位基因的存在极其稀有。在所检测的栽培稻和野生稻中仅有来源于云南景洪的直立型普通野生稻中含有Pi-ta^+等位基因。而与Pi-ta基因相比,另一个水稻抗稻瘟病基因Pib,经部分同源序列克隆及测序发现该基因在不同野生稻中的变异较大。在所克隆的不同野生稻Pib基因同源序列中,也只有来源于直立型普通野生稻的序列能按该基因的开放阅读框进行正常翻译。对不同类型普通野生稻的抗稻瘟病能力的初步鉴定结果表明,直立型普通野生稻对供试的本地稻瘟病生理小种具有较强抗性,其抗性可能源于所含的Pi-ta^+等位基因及可能有功能的Pib基因。由于普通野生稻与栽培稻同属AA基因组型,因此,云南直立型普通野生稻可通过杂交育种或基因工程途径用于栽培稻的抗稻瘟病性能改良。

聚合gs3、Pita及Pib基因创制长粒高抗稻瘟病核心粳稻种质

优质粳米的市场需求逐年增大,其中,长粒型粳米由于外观品质优异愈加受到市场青睐。中国的传统粳稻多为短圆粒型,通过引入长粒等位基因,改良短圆粒型粳稻的外观品质,并综合考虑稻瘟病抗性,创制长粒高抗稻瘟病粳稻核心种质意义重大。本研究以著名优质粳稻‘嘉禾212’为长粒gs3基因供体亲本,通过杂交、复交、标记辅助选择及花药培养有机结合的方式,开展了gs3及稻瘟病抗性基因Pita及Pib的聚合工作。研究结果表明,通过上述多种育种手段的有机结合,gs3,Pita及Pib基因被快速聚合,3份具有长粒抗稻瘟病特性的聚合系被成功创制;其中,改良系-2谷粒长宽比相比于圆粒粳稻亲本显著增大,垩白度显著降低,产量和稻瘟病抗性也保持较高水平,可作为长粒优质粳稻培育的核心种质。上述结果为以多基因聚合为目地的分子设计育种提供了理论依据。

9个抗稻瘟病基因在291份水稻种质资源中的分布及组合特征

通过对Pib抗、感稻瘟病基因型序列进行比对,开发分子标记,并搜集已报道的8个抗稻瘟病基因(Pi9、Pi-k^(h)、Pit、Pi5、Pita、Pb1、Pi2、Pikm)的分子标记,分析这9个抗稻瘟病基因在291份水稻种质资源(以黄淮海区域种质为主)中的分布及组合特征,为今后抗稻瘟病分子标记辅助选择育种提供理论依据。结果表明,成功开发了Pib基因分子标记。单份水稻种质资源中携带的抗稻瘟病基因数目为0~6个,携带3个抗稻瘟病基因的种质资源最多,占比40.9%,其次为携带2个(20.3%)和4个(19.2%)抗稻瘟病基因的种质资源,携带6个抗稻瘟病基因的种质资源最少(0.4%)。9个抗稻瘟病基因在水稻种质资源中出现的频率存在较大差异,介于7.2%~59.1%,Pi9基因出现频率最高(59.1%),Pi-k^(h)次之(50.8%),随后依次为Pib(41.2%)、Pi5(36.4%)、Pita(29.2%)、Pb1(28.8%)、Pi2(19.5%)、Pikm(17.1%),Pit基因出现频率最低(7.2%)。291份水稻种质资源中共有抗稻瘟病基因组合93个,Pi9+Pi-k^(h)+Pita组合水稻种质资源最多(18份),其次为Pi9+Pi-k^(h)+Pib组合(17份)和Pi9+Pb1组合(11份),Pi9+Pi5+Pb1、Pi9+Pi-k^(h)和Pik^(h)+Pita组合均有9份,其他组合均低于8份。