PIWIL1在不同肿瘤细胞中的差异性表达

PIWI作为AGO蛋白家族的成员,在睾丸中特异表达,在精子形成过程中扮演着重要角色.已有文献报道,PIWIL2也广泛存在于多种肿瘤中,与肿瘤的发生相关.本文旨在确定PIWL1在不同肿瘤细胞中的表达差异性,进而初步探讨PIWIL1的表达差异与肿瘤发生发展的关系.半定量RT-PCR和Western印迹检测多种肿瘤细胞中,PIWIL1在mRNA水平及蛋白水平的表达情况,进一步用免疫组化和免疫荧光检测PIWIL1在细胞中的表达及定位.PIWIL1在多种肿瘤细胞中的表达存在差异,其中一些肿瘤细胞中的表达水平较高,包括卵巢癌,前列腺癌,肝癌,胃癌等细胞.对于肿瘤细胞而言,PIWIL1定位于细胞浆中.因此,PIWIL1在多种肿瘤细胞中的表达差异性可能为肿瘤发生发展的研究提供新的线索.

鸡不同生精细胞中Piwil1基因启动子区DNA甲基化差异研究

旨在通过检测不同类型生精细胞中Piwil1基因的转录水平和启动子区甲基化状态,为深入探讨该基因在鸡精子发生过程中的转录调控机制奠定基础。通过荧光定量PCR技术检测Piwil1基因在不同生精细胞的mRNA表达水平,同时采用Bisulfite sequencing PCR法对启动子区进行甲基化修饰、转化和克隆测序,分析甲基化状态。结果发现,鸡Piwil1基因在精子中几乎不表达,在精原细胞的表达量显著高于PGCs、SSCs和四倍体(P<0.01)。鸡Piwil1基因启动子区-233^+298bp存在1个CpG岛,该岛有56个CpG位点。第1~10个CpG位点(-233^-129bp区域),精子细胞、四倍体细胞、PGCs、SSCs中处于未甲基化状态,而精原细胞中甲基化比例高达0.600;第39~55个CpG位点(+105^+252bp区域),不同细胞中的甲基化水平差异显著,精原细胞中仅为0.212。PGCs、SSCs中DNA高甲基化在一定程度上抑制了Piwil1基因的表达。研究表明:在+105^+252bp非编码区域甲基化可能对Piwil1基因转录调控有一定影响,但还存在其他转录调控机制。

PIWIL1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨干细胞相关蛋白PIWI样蛋白1(PIWI-like protein-1,PIWIL1)在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,并探索其表达与患者预后的关系.方法:应用免疫组织化学检测47例肝细胞癌标本中PIWIL1的表达,免疫印迹(Western blot)法检测31例肝细胞癌组织中PIWIL1的表达,分析PIWIL1表达与临床特征及预后的关系.结果:PIWIL1在肝癌组织中高表达,在正常肝组织中低表达,PIWIL1同肿瘤分化程度、有无临近组织侵犯有关,与肿瘤大小及甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)水平无关;其阳性表达预示患者预后较差.结论:PIWIL1的高表达同病理分化程度、临近组织侵犯相关及患者预后相关.

鸡Piwil1基因启动子区转录调控元件的初步分析

旨在确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,预测转录因子结合位点,并探讨转录因子对家禽Piwil1基因核心启动子活性的影响。通过将Piwil1基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组体质粒,将重组体分别转染COS-7和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,并对调控区进行转录因子结合位点预测;对预测的转录因子NF-Y结合位点进行定点突变,构建重组体质粒,并通过双荧光素酶报告基因检测系统分析其对启动子活性的影响。狼山鸡Piwil1基因的-1 377^-268bp区域在COS-7和GC-1细胞中都有不同程度的启动活性,-221^+1bp启动子活性几乎完全丧失,在-268^-221bp区域有转录因子NF-Y结合位点,定点突变后启动子活性显著下降,认为转录因子NF-Y对启动子活性可能起着重要的调控作用。转录因子NF-Y为Piwil1基因核心启动子区的重要调控元件,为进一步研究Piwil1基因的转录调控机制奠定了理论基础。

Piwil1基因在鸡生殖系干细胞中的表达研究

为了探讨Piwil1基因在鸡生殖系干细胞中的生物学功能,本研究以原始生殖细胞和精原干细胞为细胞模型,利用Real-time qPCR技术检测了Piwil1基因在如皋黄鸡生殖系干细胞中的相对表达量。结果表明,Piwil1基因在生殖系细胞中特异性表达,且Piwil1基因在精原干细胞中的表达量显著高于原始生殖细胞,这表明Piwil1基因可能在精原干细胞的"DNA重新甲基化"以及自我更新过程中发挥重要作用。

PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

[目的]建立PIWIL1基因启动子调控的特异性表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制奠定基础。[方法]通过PCR扩增,从猪的全基因组上扩增出PIWIL1基因的启动子。切除猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor的启动子MHC,将其与PIWIL1基因启动子连接,构建成特异性表达Cre重组酶的pPIWIL1-Cre载体。将该载体转染小型猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得阳性克隆进行核移植。[结果]获得2头PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre酶的转基因猪。[结论]成功构建了PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制提供了工具猪。

EBV相关性胃癌中PIWIL1和PIWIL4表达及与预后的相关性

目的探讨PIWIL1和PIWIL4表达与EBV相关性胃癌(EBV-associated gastric cancer,EBVaGC)临床病理学特征及预后的关系。方法收集胃腺癌111例,采用原位杂交技术鉴定EBVaGC,应用qRT-PCR检测正常胃黏膜上皮细胞株GES-1、EBV阴性胃癌细胞株MKN-28、EBV感染的胃癌细胞株AGS-BX1、胃腺癌组织及癌旁组织中PIWIL1和PIWIL4的表达,并分析其与临床病理特征的相关性;Kaplan-Meier和Logistic以及Cox分析PIWIL1和PIWIL4表达与EBVaGC预后的相关性。结果PIWIL1与PIWIL4在EBVaGC组中的表达均高于非EBV相关性胃癌(non-EBV-associated gastric cancer,EBVnGC)组(P<0.05)。PIWIL1和PIWIL4在EBVaGC中的表达量分别为0.556±0.096、0.778±0.440,在癌旁组织中的表达量为0.240±0.121、0.501±0.431,分别上调2.31倍及1.55倍(P=0.033,P=0.029)。AGS-BX1中PIWIL1与PIWIL4表达水平高于GES-1和MKN-28(P<0.01)。PIWIL1和PIWIL4表达与胃腺癌TNM分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示,PIWIL4高表达组患者的总生存期较低表达组差(P=0.007)。Logistic及Cox分析显示PIWIL4表达与EBVaGC的预后相关(P<0.05),是EBVaGC预后独立危险因素。结论EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4过表达,并与TNM分期和淋巴结转移密切相关,且PIWIL4与患者总生存期相关,是EBVaGC预后的独立危险因素,PIWIL4可能是判断EBVaGC预后的分子标志物。

RNA干扰敲减PIWIL1表达对人结肠癌细胞SW620增殖,粘附及侵袭能力影响

PIWIL1为AGO蛋白(Argonaute proteins)PIWI亚家族的成员之一,在睾丸中特异表达.其在干细胞自我更新、RNA干扰和翻译调节中起着重要的作用.本文采用实时PCR方法检测PIWI基因家族中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4在人结肠癌SW620细胞中mRNA表达水平,首次证实了在SW620细胞中,PIWIL1相对PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4,其表达水平最高(P(0.05).构建表达针对PIWIL1的小发卡结构干扰RNA的重组质粒,并用Western印迹验证其达到较高的干扰效率.用脂质体将重组质粒转染入SW620细胞中,通过MTT实验、集落形成实验、细胞聚集实验及细胞侵袭转移实验,分别观察到其可抑制SW620细胞的生长、增殖、侵袭转移能力,增强了SW620细胞的粘附能力.提示PIWIL1可能在结肠癌发生、发展过程中发挥作用.

PIWIL1在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:分析PIWIL1蛋白在胃癌组织中的表达及其临床病理意义。方法:采用免疫组织化学方法检测75例胃癌组织及癌旁组织中PIWIL1蛋白表达,分析PIWIL1蛋白的表达与胃癌临床病理特征的相关性。结果:PIWIL1在胃癌组织中的阳性表达率(80.00%)高于癌旁组织中的阳性表达率(21.33%)(P<0.05)。PIWIL1阳性表达与胃癌T分期及淋巴结转移有关(P<0.05);癌组织中PIWIL1的表达水平与年龄、性别、临床分期和分化程度无明显相关(P>0.05)。结论:PIWIL1高表达与胃癌T分期呈正相关性,参与了胃癌的发生、发展过程。

胃癌中Piwil1基因启动子区rs28416520位点单核苷酸多态性及其临床意义

目的分析Piwil1基因启动子区域的单核苷酸多态性(SNP)和胃癌的相关性。方法利用实时定量PCR检测3例胃癌患者肿瘤组织中Piwil1 mRNA的表达,并通过肿瘤转录组测序数据库分析胃癌组织中Piwil1 mRNA的表达水平。采用PCR克隆出Piwil1基因启动子区的序列,直接测序法测定24例胃癌患者和29例健康对照者的基因多态性,并使用SnapGene软件对测序结果进行分析。结果对Cancer RNA-Seq Nexus数据库查询结果和3例胃癌患者肿瘤组织和癌旁组织的实时定量PCR检测结果进行分析,发现胃癌组织中Piwil1基因表达量较癌旁组织高。检测到Piwil1基因启动子两个CpG区域的7个SNP位点,发现仅有一个SNP位点和胃癌有相关性。CpG 67区域rs28416520位点基因型GG、GA、AA在胃癌组中的频率分别为79.2%、16.7%、4.1%,在健康对照组中分别为37.9%、55.2%、6.9%,胃癌组GG基因型频率显著高于对照组(OR=0.144,95%CI:0.045~0564,χ2=9.071,P<0.01)。胃癌组rs28416520等位基因G的频率显著高于对照组(87.5%vs 65.5%;OR=0.271,95%CI:0.099~0.766,χ2=6.856,P<0.01)。其它6个SNP位点在胃癌组和正常组之间没有显著差异。结论Piwil1基因启动子CpG 67区域rs28416520位点基因型GG和等位基因G与胃癌发病风险升高相关,且Piwil1基因在胃癌肿瘤组织中表达升高。

PIWIL1rs10773771多态性与乳腺癌相关性研究

目的探讨miRNA加工剪切酶PIWIL1rs10773771多态性与乳腺癌发生发展的相关性。方法选择176例乳腺导管癌患者为乳腺癌组,216例健康体检者为对照组,采用二代测序技术对PIWIL1基因rs10773771进行分型,分析乳腺癌和健康人群中的分布频率,rs10773771基因型与乳腺癌临床分期、肿瘤大小和淋巴结转移等临床特征的相关性。结果乳腺癌人群PIWIL1rs10773771的基因型与对照组比较,差异无统计学意义。rs10773771TT基因型患者淋巴结转移与CT/CC基因型比较,差异具有统计学意义(P<0.05),TT基因型比CT/CC更容易发生淋巴结转移(OR:1.95,95%CI:1.05-3.61)。结论miRNA加工剪切酶PIWIL1rs10773771TT基因型可能是中国汉族乳腺导管癌淋巴结转移的危险因素之一。

PIWIL1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的 PIWIL1基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞增殖活性的影响,为乳腺癌的基因诊断和治疗提供理论依据。方法针对PIWIL1 mRNA序列设计合成siRNA并筛选最佳siRNA,构建pGCsilencer^(TM)H1/GFP/Neo/PIWIL1 RNAi和pGCsilencer^(TM)H1/GFP/Neo/Non RNAi重组质粒;将重组质粒导入乳腺癌MCF-7细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株;实验分为脂质体对照组、阴性质粒转染对照组(阴性对照组)及PIWIL1-shRNA重组质粒转染组(PIWIL1-shRNA组),实时荧光定量PCR法检测PIWIL1 mRNA表达水平的变化,Western blot检测细胞中PIWIL1蛋白表达,CCK-8检测干扰质粒对MCF-7细胞增殖活性的影响。结果荧光显微镜检测显示稳定表达重组质粒pGCsilencer^(TM)H1/GFP/Neo/PIWIL1 RNAi的乳腺癌MCF-7细胞株筛选成功,其PIWIL1 mRNA抑制率(74%)明显高于阴性对照组(5.4%),PIWIL1-shRNA组细胞PIWIL1蛋白表达水平显著低于脂质体对照组和阴性对照组细胞,MCF-7细胞增殖活性显著低于阴性对照组和脂质体对照组差异具有统计学意义(P <0.05)。结论重组质粒pGCsilencer^(TM)H1/GFP/Neo/PIWIL1 RNAi可抑制乳腺癌细胞中PIWIL1基因的表达,进而降低细胞活性。

环磷酰胺对雄性大鼠睾丸piwil1基因表达的影响

为探究环磷酰胺对雄性大鼠睾丸piwil1基因表达的影响,将20只雄性大鼠均分为空白组和模型组。模型组大鼠给予50 mg/kg b.w.剂量环磷酰胺进行腹腔注射,每周一次,共注射5次,空白组注射等量的生理盐水。实验结束后对所有大鼠进行称重(体重和睾丸重量),取附睾头用于精子质量检测,取睾丸进行PCR检测。结果表明:模型组大鼠体重、睾丸质量、精子活力、精子密度及piwil1 mRNA的表达水平较空白组显著降低(P<0.05),精子畸形率显著升高(P<0.05)。表明环磷酰胺能够造成的大鼠精子质量的降低,其机制可能与piwil1基因的调控密切相关。

恒河猴piwil1基因的表达

为了解人类近亲恒河猴piwil1基因的结构、表达和功能差异,利用RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil1基因,并对其编码产物进行了相应的生物信息学分析,随后检测了piwil1 mRNA在成年恒河猴10种组织中的表达情况,最后利用免疫组化方法比较了PIWIL1蛋白在成人、成年恒河猴和幼年恒河猴睾丸组织中表达的异同.结果表明,恒河猴piwil1基因全长2 586 bp,编码861个氨基酸,氨基酸数目与人类piwil1基因相同.恒河猴PIWIL1蛋白与人的PIWIL1蛋白序列同源性达99%,均含有PAZ结构域和Piwi结构域.在成人和成年恒河猴的睾丸组织中,PIWIL1蛋白均在精母细胞和精细胞的胞浆中表达,而在幼年恒河猴睾丸组织中,PIWIL1表达与成年恒河猴相比存在差异,表达量相对较低,且主要表达于生精小管的细胞的细胞核上.上述结果提示,PIWIL1蛋白在成人和成年恒河猴可能具有相同作用,但是在不同的发育阶段中PIWIL1蛋白的功能不同.

PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

Cre-LoxP重组酶系统是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的主要技术。本实验建立睾丸特异性表达Cre重组酶的转基因猪,为制备人类生殖系统疾病模型猪奠定基础。利用PCR法扩增出猪PIWIL1启动子序列2822 bp,替换本实验室保存的猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor的MHC启动子。

PIWI蛋白与结肠癌预后的相关性

背景:PIWI蛋白为人类Argonaute蛋白家族的重要成员,与多种恶性肿瘤的发生、发展和预后相关。本课题组前期研究证实PIWIL1、PIWIL3、PIWIL4与结肠癌的发生、发展显著相关。目的:在前期研究的基础上进一步探讨PIWI蛋白与结肠癌预后的相关性。方法:选择183例附有随访信息的结肠癌病例,按癌组织与癌旁组织配对制成组织芯片,以免疫组化方法检测PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4表达。采用Spearman秩相关系数分析PIWI蛋白表达与结肠癌临床病理指标间的相关性;Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验以及Cox比例风险模型分析PIWI蛋白表达与结肠癌预后间的相关性。结果:PIWIL1-4在结肠癌组织胞质中的表达均显著高于癌旁组织(P=0.000),且与肿瘤T分期呈正相关(P<0.01)。生存分析显示癌组织PIWIL1低表达者总生存期显著长于高表达者(P=0.036),但PIWIL1并非结肠癌预后的独立相关因素。结论:PIWI蛋白参与了结肠癌的发生、发展过程,PIWIL1有望作为结肠癌预后的重要分子标记物。

肝细胞癌组织中前列腺干细胞抗原、piwi样蛋白1和T-box转录因子2的表达分析

目的 探讨前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）、piwi样蛋白1（piwi-like 1,PIWIL1）和T-box转录因子2 （T-box transcription factor 2,TBX2）的表达在肝细胞癌（HCC）中的临床意义.方法 收集2000～2003年HCC和相应癌旁正常组织所制备的石蜡切片各64例,应用免疫组织化学SP方法检测石蜡切片中PSCA,PIWIL1和TBX2蛋白的表达,分析三者的表达与HCC患者临床病理指标的关系.结果 在64例HCC的癌旁正常组织中,PSCA,PIWIL1和TBX2的表达率分别为17％ （11/64）,0％（0/64）和9％（6/64）,而HCC中三者的表达率分别为73％ （47/64）,19％（12/64）和75％ （48/64）,PSCA,PIWIL1和TBX2的表达明显高于癌旁正常组织（x2=40.859,13.241,56.505,P均＜0.05）;PSCA,PIWIL1和TBX2的表达均与患者性别、年龄无明显相关性（x2=0.651～3.864,P值均＞0.05）,但是均与临床分期有关（x2=12.923～39.511,P值均＜0.05）;PSCA的表达率随着HCC的病理分级而升高（x2=18.047,P=0.000）,而PI-WIL1和TBX2的表达则与病理分级无明显相关性（x2=3.356～5.688,P值均＞0.05）;除了PIWIL1以外（x2=3.156,P=0.078）,PSCA和TBX2的表达与淋巴结转移有相关性（x2=6.409～8.466,P值均＜0.05）;PSCA和PIWIL1的免疫染色定位于肝细胞的胞浆中,而TBX2则定位于肝细胞的胞浆和胞核中.结论 PSCA,PIWIL1和TBX2在HCC中的表达研究为HCC发生发展分子机制提供了新的资料,PSCA和TBX2可能会成为治疗肝细胞癌的分子靶点.

多花黄精对少弱精子症大鼠生精细胞凋亡的保护作用及药效物质基础研究

目的阐明多花黄精对少弱精子症大鼠模型生精细胞凋亡的保护作用及药效物质基础。方法采用UHPLC-Q Exactive Focus HRMS技术鉴定多花黄精化学成分,及其提取物灌胃给予大鼠后在血清和睾丸组织中的化学成分。设置空白组、模型组、阳性药组(左卡尼汀300 mg/kg)及多花黄精高、中、低剂量组(10、5和2.5 g/kg),考察其改善少弱精子症的药理作用,每组6只大鼠。通过HE染色观察大鼠睾丸组织病理形态,TUNEL染色观察大鼠睾丸生精细胞的凋亡情况,免疫荧光法检测DNMT3A和PIWIL1蛋白表达。结果从多花黄精提取物、大鼠血清、大鼠睾丸中分别鉴定出138种、23种、30种化学成分。模型组大鼠睾丸曲细精管中大量生精细胞凋亡,DNMT3A和PIWIL1蛋白低表达,而多花黄精高、中剂量组大鼠睾丸曲细精管中TUNEL阳性生精细胞数量减少,DNMT3A和PIWIL1蛋白表达显著升高。结论多花黄精对少弱精子症大鼠具有保护作用,其可能是通过上调大鼠睾丸中DNMT3A和PIWIL1的表达,逆转生精细胞的凋亡。

microRNA合成通路基因SNP与头颈鳞癌发病风险的关联研究

目的 探讨microRNA合成通路基因单核苷酸多态性（SNP）与头颈鳞癌发病风险的关联。方法 采用病例对照研究设计，纳入年龄（±5岁）、性别频数匹配的576例头颈鳞癌患者和1 552名健康对照。应用Illumina Infinium BeadChip平台检测microRNA合成通路上DICER1、GEMIN3、PIWIL1的8个潜在功能性SNP位点。通过单因素和多因素logistic回归模型分析不同基因型与头颈鳞癌间的关联。结果 PIWIL1 rs1106042（G〉A）的等位基因频率在病例组和对照组中的差异有统计学意义（P=0.011）；在调整年龄、性别、吸烟和饮酒等因素后，携带rs1106042 A等位基因的基因型个体发生头颈鳞癌的风险降低（相加模型：aOR=0.73，95% CI：0.57～0.93， P=0.011）；分层分析显示，rs1106042 A等位基因在年龄≥60岁、女性、非吸烟、非饮酒、口腔癌亚组中具有降低肿瘤发病风险的效应（P〈0.05）。结论 PIWIL1基因的潜在功能SNP位点可能与中国人群头颈鳞癌的发病风险相关。