盐酸小檗碱通过抑制PKCα磷酸化抑制机械牵张力诱导的血管平滑肌细胞增殖和凋亡

[目的]观察机械牵张力(SS)是否通过激活PKCα诱导小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡,并探讨盐酸小檗碱(BBR)对它的作用及机制。[方法]实验共分6组:正常对照组、BBR组、PKCα抑制剂(Go6976)组、SS组、SS+BBR组、SS+Go6976组。静息培养的细胞给予BBR或Go6976预处理1 h,继而予10%强度的SS刺激15 min后收集细胞,Western blot检测PKCα和MAPK(ERK、JNK、p38)磷酸化水平。BBR或Go6976预处理1 h,牵拉时间为1 h,继续培养23 h,免疫荧光法检测细胞增殖(Ki67)和凋亡(TUNEL)。[结果]Western blot与免疫荧光结果显示,与正常对照组相比较,SS可升高PKCα和MAPK(ERK、JNK和p38)磷酸化水平(P<0.05),并增加VSMC的增殖和凋亡水平(P<0.05)。BBR可抑制PKCα和ERK、JNK、p38磷酸化水平(P<0.05),同时抑制VSMC增殖和凋亡(P<0.05);Go6976可抑制PKCα和ERK、JNK磷酸化水平(P<0.05),但对p38磷酸化的增加没有影响,同时抑制VSMC增殖和凋亡(P<0.05)。[结论]BBR通过抑制SS诱导的VSMC的PKCα和MAPK磷酸化,抑制VSMC增殖和凋亡。

PKCα-NLRP3信号通路在小鼠急性肺损伤过度炎症反应中的作用机制

目的:研究细胞焦亡在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)过度炎症反应中的作用,并探讨蛋白激酶Cα(PKCα)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路在细胞焦亡发生发展中的调节机制。方法:(1)雄性C57BL/6J小鼠经腹腔注射0.15 mg/kg钙磷蛋白C(calphostin C)干预PKCα表达,经气道内滴注LPS(10 mg/kg)构建ALI模型,设置对照组、calphostin C组、LPS组和LPS+calphostin C组,每组12只。检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子分泌和氧化应激活性,以及肺内细胞焦亡水平。(2)RAW264.7细胞分别用calphostin C(100 nmol/L)及活性氧(ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC;2.5 mmol/L)干预,再经1 mg/L LPS刺激建立细胞模型,设置对照组、LPS组、LPS+calphostin C组和LPS+NAC组。高内涵成像分析系统检测各组细胞内ROS水平,免疫荧光检测细胞硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)表达量,Western blot检测PKCα-NLRP3信号通路相关蛋白的表达。结果:(1)气道内滴入LPS诱导小鼠BALF中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌水平显著升高,丙二醛(MDA)含量显著增加,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活性显著降低(P<0.01),肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+calphostin C组小鼠BALF中炎症因子水平显著降低(P<0.05),MDA含量显著减少,SOD和GSH活性显著增强(P<0.01),肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。(2)细胞模型中,与对照组相比,LPS组巨噬细胞ROS生成显著增加(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+calphostin C组和LPS+NAC组巨噬细胞ROS水平显著降低(P<0.01),TXNIP表达下调(P<0.01),NLRP3、cleaved caspase-1和含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)蛋白水平降低,IL-1β和IL-18分泌减少(P<0.01)。结论:PKCα通过介导TXNIP-NLRP3信号通路而调控细胞焦亡过程,从而参与小鼠ALI中的过度炎症反应。

PKCα-AnnexinA2-S100A10在胃癌组织中的表达及意义

目的:观察蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、Annexin A2和S100A10蛋白在胃癌组织中的表达及意义,为获取胃癌诊断相关的蛋白分子提供实验依据.方法:Western blot分析PKCα、Annexin A2和S100A10蛋白在正常胃黏膜与胃癌组织中的表达情况;免疫组织化学染色观察组织芯片中三者的表达情况,并分析其临床病理学意义.结果:(1)Western blot检测结果显示,PKCα、Annexin A2和S100A10蛋白在胃癌组织中表达较正常胃黏膜组织中高(P<0.01);(2)免疫组织化学染色结果显示,PKCα蛋白在正常胃黏膜及胃癌组织中的阳性表达率分别为8.82%(3/34)和76.54%(62/81);Annexin A2蛋白在正常胃黏膜及胃癌组织中的阳性表达率分别为5.88%(2/34)和79.01%(64/81);S100A10蛋白在正常胃黏膜及胃癌组织中的阳性表达率分别为2.94%(1/34)、59.26%(48/81);(3)PKCα、Annexin A2和S100A10蛋白在胃癌组织中的阳性表达率较正常胃黏膜组织高(P<0.01).结论:PKCα、Annexin A2和S100A10蛋白在胃癌组织中表达较正常胃黏膜组织中表达高,其表达与胃癌的发生及分化程度有关.

miR-216a通过靶向调控PKCα促进胃癌细胞凋亡的研究

目的本文旨在明确miR-216a是否通过靶向调控PKCα表达而抑制胃癌细胞增殖和促进其凋亡,从而进一步揭示miR-216a的抑瘤分子机制。方法首先构建PKCα3′UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告检测观察miR-216a对PKCα3′UTR-荧光素酶活性的影响;将miR-216a模拟物转染胃癌细胞MGC-803,采用Western blot检测PKCα蛋白表达水平;将PKCαsiRNA转染MGC-803,通过MTS细胞增殖活性检测和Annexin V-FITC/PI凋亡实验考察PKCα下调对MGC-803增殖和凋亡的影响。结果荧光素酶报告检测显示,miR-216a能特异性地与PKCα3′UTR结合,抑制其荧光素酶活性,下调36%。过表达miR-216a的MGC-803PKCα蛋白表达水平降低。siRNA干扰PKCα表达能抑制MGC-803的增殖和侵袭能力,它能部分模拟miR-216a的抑瘤功能。结论 miR-216a通过靶向PKCαmRNA 3′UTR而抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力。

人肝再生增强因子对体外单个核细胞PKCα-NF-κB及IL-2的影响

目的观察人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)对人外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclear cell,PBMC)PKCα-NF-κB及IL-2的影响,探讨hALR免疫抑制机制。方法用梯度离心法分离正常人PBMC,分成正常对照组、刀豆蛋白A(ConA)刺激组(ConA组)和hALR干预组(ConA+hALR组)。ConA组用5μg/mlConA刺激细胞增殖和分泌细胞因子IL-2;ConA+hALR组用30μg/mlhALR对ConA刺激进行干预。于细胞培养0、8、16、32、40h时,用MTT法测定细胞增殖程度,Westonblot检测细胞内信号通路PKCα-NF-κB表达含量,Fluo-3AM装载检测胞内钙离子浓度,用双抗夹心酶联法检测上清细胞因子IL-2含量。结果ConA组细胞增殖逐渐加强,16h时与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05);PKCα、NF-κB表达上调及上清IL-2含量增加趋势一致,在16h达到高峰(P<0.05)。ConA+hALR组细胞没有增殖,PKCα-NF-κB表达及上清IL-2含量最高峰后移至32h。每个时间点各组细胞内Ca2+浓度没有差别。结论hALR可能通过抑制PKCα-NF-κB通路阻碍IL-2的产生速度进而抑制免疫。

宫颈癌组织中PKCα、PKCε、PKCδ表达及与化疗药物敏感性的机制研究

目的:探讨宫颈癌组织中PKCα、PKCε、PKCδ表达及其与化疗药物敏感性的关系。方法:选择本院收治的确诊宫颈癌患者38例,三维彩色多普勒超声检测血管形成指数(VI)、血流指数(FI)、血管血流指数(VFI),取化疗前后病灶组织各100mg左右,采用RT-PCR检测组织中PKCα、PKCε、PKCδmRNA表达水平,Western blot检测组织中PKCα、PKCε、PKCδ蛋白的表达,Spearman相关分析PKCα、PKCε、PKCδmRNA表达水平与化药敏感性的关系,Logisitic回归分析影响化疗敏感性的相关因素。结果:化疗后PKCα、PKCεmRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),PKCδmRNA和蛋白的表达均显著升高(P<0.05);化疗后有效组PKCα、PKCεmRNA和蛋白表达水平较化疗前均显著降低(P<0.05),PKCδmRNA和蛋白的表达较化疗前均显著升高(P<0.05);Spearman分析化疗前宫颈癌组织中PKCα与PKCε的mRNA表达水平与VI、FI和化疗后残余肿瘤体积百分比呈显著正相关,PKCδ与VI、FI和化疗后残余肿瘤体积百分比呈显著负相关,而与VFI和化疗前肿瘤的体积大小无明显相关性;Logisitic回归分析显示PKCα、PKCε、PKCδmRNA、VI、FI为化疗敏感性的独立危险因素,淋巴结转移、肿瘤体积与化疗敏感性无关。结论:PKCα、PKCε在宫颈癌组织中高表达,PKCδ在宫颈癌组织中低表达,三者均与化疗敏感性具有密切关系。

PKCα、PKCβⅠ与早期糖尿病肾病关系

糖尿病肾病是糖尿病严重的并发症，糖尿病导致的肾脏损害几乎可以累积肾脏所有结构，从肾小球、肾小管、肾脏间质和血管，糖尿病患者一旦出现肾脏损害其进展程度远远快于非糖尿病患者。

PKCα、β_1、ε、ζ表达在缺氧预适应中的变化

目的 测定在缺氧预适应中脑组织 PKCα、β1 、ε、ζ表达的变化 ,探讨缺氧预适应形成机制。方法 采用流式细胞仪多克隆抗体间接免疫荧光技术测定。结果 随着缺氧次数的增加 ,PKCα、β1 、ε、ζ表达各亚型程度不同地持续增强 ,但 4次缺氧组有所回降。结论 PKC可能通过减弱其所引发的一系列病理变化 。

氯化甲基汞对仔鼠小脑PKCα mRNA表达的影响

目的:观察氯化甲基汞对仔鼠小脑中PKCαmRNA表达的影响。方法:建立氯化甲基汞致仔鼠小脑发育损伤大鼠实验模型。采用核酸原位杂交方法检测α型蛋白激酶C(PCKα)mRNA表达。结果:和对照组相比,各实验组仔鼠在出生后3天至出生后30天,小脑蒲肯野细胞PKCαmRNA表达均明显增高。小脑蒲肯野细胞PKCαmRNA表达随出生后时间的延长,其表达量逐渐增多。并且氯化甲基汞浓度与PKCαmRNA表达量呈正比,随氯化甲基汞浓度增高,小脑蒲肯野细胞PKCαmRNA表达明显增多。结论:氯化甲基汞以剂量依赖方式和时间依赖方式促进仔鼠小脑蒲肯野细胞PKCαmRNA表达。氯化甲基汞可通过上调神经元中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进小脑神经元凋亡进而损伤中枢神经系统。

PKCα抑制剂Calphostin C抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞迁移

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可以诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的迁移,但其促进迁移机制尚不清楚.研究使用Calphostin C抑制剂来抑制PKCα的活性,从而研究TNF-α诱导MSCs迁移的作用是否通过激活PKCα来完成.利用50,ng/m L的TNF-α处理MSCs,划痕实验和Transwell实验表明TNF-α可以诱导MSCs的迁移.加入PKCα的抑制剂Calphostin C后,可以抑制TNF-α对MSCs迁移或侵袭的诱导,并降低迁移标志基因MYL9(Myosin light chain 9,MYL9)、CYR61(Cysteine rich 61,CYR61)的表达.以上结果表明,PKCα抑制剂Calphostin C可以抑制TNF-α诱导的MSCs迁移.

MLC20磷酸化在PKCα、PKCε调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用

目的观察肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化在蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)调节大鼠失血性休克后血管钙敏感性中的作用,进一步探讨休克血管钙失敏的发生机制。方法采用缺氧大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和失血性休克后大鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA),运用Western blot、底物磷酸化等技术方法,观察PKCα、PKCε激动剂作用下,以及抑制CPI-17、ILK、ZIPK后再给予PKCα、PKCε激动剂时,肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)活性和MLC20磷酸化的变化。结果①缺氧2h后VSMC中MLCP活性增高至正常对照的150.1%(P<0.01),PKCα、PKCε激动剂可显著抑制其增高,使其分别降低至正常对照的103.0%和96.3%(P<0.01),抑制CPI-17、ILK、ZIPK,可显著抑制PKCα激动剂降低MLCP活性的作用,使其分别增高至正常对照的136.7%、127.6%和116.7%(P<0.01);抑制CPI-17、ILK、ZIPK,也可显著抑制PKCε激动剂降低MLCP活性的作用,使其分别增高至134.0%、128.5%和126.0%(P<0.01)。②失血性休克2h后SMA中MLC20磷酸化水平由32.4%显著降低至10.4%(P<0.01),PKCα、PKCε激动剂可显著抑制其降低,使其分别增高至26.4%和25.6%(P<0.01),抑制CPI-17、ILK、ZIPK,可显著削弱PKCα激动剂的增高MLC20磷酸化的作用,使其分别降低至12.7%、10.0%和15.7%(P<0.01);也可显著削弱PKCε激动剂增高MLC20磷酸化的作用,使其分别降低至10.1%、12.5%和10.3%(P<0.01)。结论PKCα、PKCε可能通过CPI-17、ILK、ZIPK调节MLCP活性和MLC20磷酸化,调节失血性休克血管平滑肌的钙敏感性。

胶质瘤中PKCα表达及与细胞增殖和凋亡的关系

目的 探讨人脑胶质瘤中PKCα的表达情况 ,以及与细胞增殖和凋亡的关系。方法 37例人脑胶质瘤标本 ,星形细胞瘤 2 5例和胶质母细胞瘤 12例 ,正常脑组织 10例作为对照。PKCα和Ki 6 7的检测用免疫组化 ,细胞凋亡用TUNEL。用Ki 6 7LI和AI对增殖和凋亡进行评估。结果 PKCα在胶质瘤及正常组织中均有表达 ,前者为 6 7.6 % ,后者为 30 .0 % ,二者有显著性差异 ,星形细胞瘤阳性率为 6 0 % ,胶质母细胞瘤为 83.3% ,不同肿瘤分型中PKCα表达有差异 ,PKCα表达与细胞增殖和生长显著相关 ,与凋亡无明显相关。结论 人脑胶质瘤中PKCα过度表达 。

中药复方对戊四氮致痫大鼠海马PKCα表达的干预作用

目的:观察戊四氮(PTZ)致痫大鼠海马神经元PKCα表达以及中药复方AAP的影响。方法:健康成年雄性Wistar大鼠,随机分为6组(n=24):正常组(Normal);②模型组(PTZ);③中药大剂量组(AAPl)、④中药中剂量组(AAPm)、⑤中药小剂量组(AAPs)、⑥西药丙戊酸钠组(VPA)。复制戊四氮致痫大鼠模型,于致痫后12h、2天、5天、7天相应时间点取材,制备脑标本;免疫组化技术检测海马神经元PKCα表达。结果:正常组海马内PKCα阳性细胞表达较少;与正常组相比,模型组大鼠海马PKCα阳性细胞表达增加(P<0.05),差异显著;与模型组比较,中药AAPl、AAPm、AAPs各组PKCα阳性表达减少;7天,与模型组及VPA组相比,中药AAPl、AAPm、AAPs各组PKCα阳性表达降低,P<0.05,差异显著。与PTZ组相比,VPA组海马CA3区PKCα阳性表达无显著差异(P>0.05)。结论:PKCα在PTZ致痫大鼠海马中表达增强,可能在癫痫发作中起作用;中药复方AAP可降低致痫大鼠海马PKCα表达,有一定脑保护作用。

PLCε通过PKCα/β/TBX3信号通路调控人膀胱癌细胞系T24的迁移和侵袭

目的体外实验研究PLCε基因调节人膀胱癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法设计并合成针对PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列,构建重组腺病毒Ad-sh PLCε。T24细胞感染Ad-sh PLCε腺病毒后,用Western blot检测PKCα/β及TBX3、E-cadherin的表达;用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测膀胱癌细胞T24的迁移、侵袭能力。结果 Ad-sh PLCε重组腺病毒感染膀胱癌细胞T24,对其PLCεmRNA表达抑制率为75.6%,对其PLCε蛋白表达抑制率为67.4%。Ad-sh PLCε感染组T24细胞迁移能力较空载组和空白对照组明显减弱(P<0.05);重组腺病毒Ad-sh PLCε感染组T24细胞穿膜细胞数较空载组和空白对照组明显减少(P<0.05)。Ad-sh PLCε重组腺病毒感染膀胱癌T24细胞后下游PKCα/β的活化受到抑制(P<0.05),同时,TBX3的表达减少,而E-cadherin的表达增高(P<0.05)。结论通过以重组腺病毒干扰抑制PLCε基因,能有效抑制膀胱癌T24细胞系中PLCε下游PKCα/β的活化情况及TBX3,E-cadherin的表达变化,并且对T24细胞的迁移、侵袭能力具有一定的抑制作用。

表达PKCα反义RNA对人肺癌细胞增殖的影响

运用基因重组和基因转染技术 ,将 PKCα c DNA反向插入的重组质粒 p XJ41 - CKPα导入人肺癌 LTEPa- 2细胞 .经 Northern印迹 ,Western印迹等检验 ,表明成功地建立了稳定表达 PKCα反义 RNA的人肺癌细胞 (LT· AS4) .进一步研究了表达 PKCα反义 RNA对人肺癌细胞 LTEPa-2增殖的影响 .结果表明 ,表达 PKCα反义 RNA可抑制人肺癌细胞增殖速率 ,流式细胞光度术检测 ,G1 期细胞百分数增加 ,S期细胞百分数降低 ,并进一步探讨了其作用机理 ,观察到与增殖相关基因 c- myc、Ca M和 Cyclin B1的表达水平均下降 .这可能是 PKCα表达被阻抑。

急性力竭运动对大鼠心肌PKCα、δ和ε表达的影响

目的:检测分析急性力竭运动对大鼠心肌蛋白激酶C(PKC)α、δ和ε亚型总蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响。方法:健康雄性SD大鼠50只,随机分为对照组(C组)和急性力竭运动组(AEE组)(n=25),采用一次力竭跑台运动建立急性力竭运动模型,Western blot法检测PKCα、δ和ε总蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平。结果:与C组比较,AEE组大鼠心肌PKCα、p-PKCα^(Ser-657)、PKCδ、P-pKCδ^(Thr-507)及PKCε水平均显著升高(P<0.0S)。结论:急性力竭运动导致PKCα、PKCδ、PKCε表达水平和PKCα、PKCδ活化水平上调,可能是急性力竭运动导致大鼠心肌损伤的重要因素,三亚型之间的交互作用可能是更重要的因素。

PKCα、PKCβⅡ、PKCδ在甲状腺病变中的表达

目的:对PKCα、PKCβⅡ、PKCδ在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及乳头状甲状腺癌中的表达进行研究,以了解它们在甲状腺病变发生发展中的作用。方法:采用免疫组织化学检测方法分别检测PKCα、PKCβⅡ、PKCδ在30例结节性甲状腺肿、20例甲状腺腺瘤、31例乳头状甲状腺癌的表达情况,并进行对比分析。结果:PKCα,PKCβⅡ,PKCδ的表达在结节性甲状腺肿组与甲状腺腺瘤组无差异(P>0.05);在乳头状甲状腺癌组明显高于结节性甲状腺肿组及甲状腺腺瘤组,即在良性病变组与恶性病变组存在显著性差异(P<0.05)。结论:PKCα、PKCβⅡ、PKCδ在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤、乳头状甲状腺癌中均有表达;在甲状腺乳头状癌中有过度表达。

人PKCα蛋白结构和功能的生物信息学分析

目的进行人蛋白激酶Cα(PKCα)蛋白结构和功能的生物信息学分析,为人PKCα的调控机制及生物学功能提供理论基础。方法利用NCBI、TMHMM、ProtComp、ProtParam等数据库和生物信息学分析工具,对人PKCα蛋白的结构、性质、功能域及蛋白质空间结构进行分析。结果人PKCα属不稳定蛋白,为非跨膜亲水性蛋白,无信号肽属于非分泌性蛋白,具有磷酸化位点。其二级结构主要是无规则卷曲,三级结构主要是蛋白质扭曲。无二硫键,有离子通道活性和钙释放通道活性,参与离子转运并与多种蛋白存在相互作用关系。结论人PKCα蛋白在参与和调节离子转运、细胞死亡、能量代谢等许多生理过程中起着重要的作用。

PKCαsiRNA转染对人胃癌裸鼠皮下移植瘤形成的抑制作用研究

目的:探讨PKCαsiRNA作用后的胃癌细胞株BGC823在裸鼠皮下的成瘤能力。方法:利用脂质体将PKCαsiRNA导入BGC823细胞内,然后将这种被转染的细胞接种于裸鼠皮下,观察肿瘤体积的变化,并计算抑瘤率。结果:经脂质体PKCαsiRNA作用后的胃癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低,最大抑瘤率达40.0%(P<0.05)。首次出现目检可见肿瘤的平均时间延长为9.6天(P<0.05)。结论:PKCαsiRNA能降低胃癌细胞的成瘤能力,抑制肿瘤生长,在胃癌的基因治疗中有一定价值。

PKCα在人脑胶质瘤细胞中的表达及意义

目的 研究PKCα在人脑胶质瘤细胞中的表达水平及意义。方法 用免疫组化法检测61例胶质瘤标本及4例正常胶质细胞中PKCα的表达水平,分析其表达水平与胶质瘤恶性级别的相关性及意义。结果 在恶性胶质瘤中,PKCα有高表达,但在Ⅱ～Ⅳ级胶质细胞瘤中PKCα表达水平与肿瘤级别呈负相关;在Ⅰ级星形细胞胶质瘤和正常胶质细胞内表达较低。结论PKCα在恶性胶质瘤中具有重要作用,可能与胶质瘤的发生、发展有关。