DNA-PKcs、Ku80及ATM备选宫颈癌放疗增敏靶点的体外研究

背景与目的:DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)是细胞受辐射后最致命的损伤,而DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、Ku80和ATM(ataxia-telangiectasia mutated)为DSB的主要修复蛋白。宫颈癌是以放疗为主要治疗手段的肿瘤,但其肿瘤细胞对放射线的敏感性不同。本实验拟研究3种DSB修复蛋白的表达与宫颈癌细胞放射敏感性的关系,并探讨DSB修复蛋白成为宫颈癌放疗增敏靶点的可能性。方法:免疫组化法检测41例宫颈癌患者组织中DNA-PKcs、Ku80和ATM蛋白的表达情况;Western blot检测8株肿瘤细胞(包括4株宫颈癌细胞)中3种蛋白的表达,克隆形成实验检测SF2(survival fraction at 2 Gy)、&值,分析蛋白表达水平和SF2、&值的关系;利用靶向抑制DNA-PKcs的shRNA表达质粒和小分子抑制剂LY294002,分别抑制HeLa细胞DNA-PKcs蛋白表达和活性后,克隆形成实验和流式细胞仪检测HeLa细胞受6MVX线照射后的SF2、&值和凋亡率变化。结果:在41例宫颈癌组织中,Ku80、DNA-PKcs和ATM的阳性率分别为70.73%、68.29%和19.51%;8株肿瘤细胞中Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白的相对表达量与各细胞SF2、&值各不相同,作Pearson线性相关分析后得出DNA-PKcs的表达水平与SF2之间有明显的正相关关系(r=0.72,P=0.04);靶向抑制DNA-PKcs的shRNA可以促进HeLa细胞的放射敏感性,其SF2值为0.37,显著低于对照HeLa细胞的0.53(P<0.05);单独接受50μmol/LLY294002作用1hHeLa细胞的凋亡率未见明显增加,但先经LY294002处理再照射6Gy的HeLa细胞在48h和72h的凋亡率比单独照射6Gy的HeLa细胞凋亡率显著增加(48h点:t=3.25,P=0.03;72h点:t=3.01,P=0.04)。结论:DNA-PKcs在宫颈癌组织中表达较高,且其表达水平可以预示肿瘤细胞的放射敏感性;抑制DNA-PKcs的表达或活性可以促进HeLa细胞的放射敏感性。

不同非小细胞肺癌细胞株中DNA-PKcs的表达及其与放射敏感性的关系

背景与目的:DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)在电离辐射引起的DNA双链断裂的修复过程中起着关键作用,可影响组织细胞对放射治疗的敏感性。本研究通过检测DNA-PKcs在不同组织学类型非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞中的表达情况,探讨其与放射敏感性的关系。方法:Westernblot及DNA-PK活性分析法检测NSCLC细胞株A549、H1299、L78、PGCL3和H460中DNA-PKcs的含量与活性。成克隆实验分别测定各细胞株照射后的剂量-存活曲线,并分析放射敏感性与DNA-PKcs的关系。结果:成克隆实验结果显示:不同NSCLC细胞株的放射敏感性不同,A549细胞2Gy剂量照射下的存活分数(survival fractionat2Gy,SF2)为0.74,H1299细胞为0.25,H460细胞为0.21,PGCL3细胞为0.48,L78细胞为0.58。Westernblot显示各NSCLC细胞株中DNA-PKcs的表达有差异,A549细胞的DNA-PKcs表达水平为3.26±0.98,L78细胞为0.51±0.07,H1299细胞为0.51±0.11,H460细胞为0.86±0.23,PGCL3细胞为2.60±0.76。A549细胞的DNA-PKcs活性为8.30±1.03,H1299细胞为2.45±0.52,H460细胞为0.11±0.02,PGCL3细胞为4.13±0.87,L78细胞为0.42±0.07。在腺癌及大细胞癌中SF2与DNA-PKcs含量(P<0.05,r=0.95)及活性(P=0.03,r=0.98)呈线性相关。结论:在腺癌及大细胞癌中,DNA-PKcs是判断细胞放射敏感性的重要因素。

DNA-PKcs反义核酸增强HeLa细胞对辐射及化疗药物顺铂的敏感性

目的构建表达DNA-PKcs反义核酸的真核表达载体,建立DNA-PKcs表达被反义核酸抑制的细胞模型。方法采用RT-PCR扩增DNA-PKcs的cDNA片段,DNA重组技术构建四环素控制表达的真核表达载体;利用Lipofectamine介导基因转染,Westernblot分析鉴定反义核酸抑制DNA-PKcs表达的细胞模型;细胞克隆形成法和细胞生长曲线分析细胞对UV和顺铂的敏感性。结果克隆了DNA-PKcs5'端320bpcDNA片段,重组于tet启动子控制表达质粒pCIneo-Tet-splice,转染Hela细胞,获得3个稳定转化克隆;Westernblot结果表明细胞中DNA-PKcs表达受到反义核酸的抑制,并且细胞对紫外线辐射和顺铂敏感性增加。结论成功建立了DNA-PKcs表达受到反义核酸抑制的细胞模型,抑制DNA-PKcs表达提高了细胞的辐射和顺铂的敏感性。

肝癌组织DNA-PKcs过量表达及其靶向siRNA分子的抗增殖作用

目的:研究肝癌组织中DNA依赖蛋白激酶催化亚基DNA-PKcs的表达差异及其生物学意义.方法:用组织芯片和免疫组化法检测肝胆癌组织86例,肝胆管结石切除肝组织17例标本和正常肝组织70例中DNA-PKcs蛋白表达情况,Western blot检测培养细胞中DNA-PKcs表达,Lipofectamine 2000介导DNA-PKcs的siRNA质粒DNA转染,细胞生长曲线分析细胞增殖,克隆形成法分析细胞辐射敏感性.结果:组织芯片检测显示,60例肝癌组织细胞中DNA-PKcs阳性表达率<25%(极低表达),25%-50%(低表达),51%-75%(中等表达)和>75%(高表达)分别占15%,20%,23.3%和41.7%,而64例正常肝组织中各DNA-PKcs阳性表达率分别为68.7%,10.9%,12.6%和7.8%,表明癌组织DNA-PKcs的表达水平显著高于正常组织(P=0.0008).26例肝癌组织病理切片的免疫组化结果也显示,其DNA-PKcs表达水平显著高于23例非肿瘤性肝组织(P= 0.001).Western blot检测结果显示,体外培养的肝癌细胞HepG2,7721和7402中DNA-PKcs表达水平,同样显著高于正常肝细胞LO2.siRNA分子靶向抑制DNA-PKcs表达,不但显著提高HepG2细胞对电离辐射的敏感性,同时还降低肝癌细胞的增殖速度.随着DNA-PKcs表达的抑制,癌基因c-Myc蛋白表达水平也显著降低.结论:肝癌组织细胞中DNA-PKcs表达水平显著高于正常肝组织和非肿瘤性肝病理组织,siRNA抑制DNA-PKcs表达,具有抗癌细胞增殖和放射增敏作用,c-Myc蛋白表达抑制可能是其抗增殖作用的相关机制之一.

DNA-PKcs在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义

背景与目的:DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)是射线杀灭肿瘤细胞的主要机制,而同源重组(homologous recombination,HR)和非同源性末端连接(DNA nonhomologous end-joining,NHEJ)是DSB的两条重要修复途径。DNA-PK催化亚单位(catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs)是NHEJ途径的主要修复蛋白之一,在DSB中发挥着重要作用。本研究旨在通过检测鼻咽癌组织中DNA-PKcs的表达情况,探讨其与鼻咽癌临床病理特征及预后的关系。方法:采用免疫组化SP法检测223例鼻咽癌患者组织中DNA-PKcs的表达,并结合患者的临床及预后资料进行分析。结果:223例鼻咽癌患者中,DNA-PKcs的过表达率为36.8%。卡方检验显示,DNA-PKcs表达强弱与患者的性别、年龄、病理分型及N分期的相关性均无统计学意义(P>0.05),与TNM分期、T分期、M分期均有关(P<0.05)。单因素生存分析显示,DNA-PKcs过表达患者5年总生存率低于低表达患者(54.6%vs.79.4%),差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归模型分析显示T、N、M分期及DNA-PKcs表达水平是影响鼻咽癌患者预后的独立因素(P<0.05)。结论:DNA-PKcs在大部分鼻咽癌组织中均有表达,DNA-PKcs的表达水平与鼻咽癌患者预后相关,对患者的预后判断有一定的指导意义。

沉默DNA-PKcs对细胞信号转导相关基因转录的影响

利用RNA干扰技术构建DNA-PKcs表达抑制细胞模型,探讨DNA-PKcs对HeLa细胞信号转导相关基因表达的调控作用.通过观察细胞对辐射及顺铂的敏感性,鉴定细胞表型变化.用寡核苷酸芯片检测细胞信号转导相关基因的转录谱,并用RT-PCR方法和SEAP检测系统进一步验证基因的表达变化.所筛选出的DNA-PKcs表达抑制细胞对辐射及顺铂的敏感性升高,15个与细胞信号转导相关的基因表达升高,其中7个是与干扰素信号转导反应相关的基因.8个表达下降,包括有细胞增殖分化相关基因,如NFAT.RT-PCR检测结果与芯片结果相一致,利用SEAT报告系统检测,进一步证实NFAT转录活性下调.实验结果表明,DNA-PKcs除了参与DNA修复外,还调控细胞信号转导相关基因的表达,而且大多与细胞增殖分化相关.

β-榄香烯乳联合照射对DNA-PKcs基因表达及凋亡的影响

目的探讨β-榄香烯乳影响肺腺癌A549细胞凋亡及DNA-PKcs基因表达的放射增敏机制。方法实验分为对照组、单纯照射组(4Gy照射)、单纯药物组(10μg/ml、20μg/mlβ-榄香烯乳)、药物+照射组(10μg/ml、20μg/mlβ-榄香烯乳+4Gy照射)。采用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测β-榄香烯乳对肺腺癌A549细胞的半数抑制浓度(IC50);克隆形成实验计算细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡率;逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测细胞DNA-PKcs基因mRNA表达量。结果MTT法测得β-榄香烯乳对A549细胞的IC50值为120μg/ml;克隆形成实验证明β-榄香烯乳对A549细胞有放射增敏作用;药物+照射组细胞G2/M期比率及凋亡率明显高于单纯照射组及单纯用药组(P<0.05);药物+照射组DNA-PKcs基因mRNA表达量与单纯照射及单纯用药组相比明显下降(P<0.05)。结论β-榄香烯乳可通过促进A549细胞凋亡及抑制DNA-PKcs基因mRNA表达实现对A549细胞放射增敏作用。

基于PKCS的数据安全框架及支持库设计

提出了一个基于 PKCS( Public Key Cryptography Standards)的数据安全框架 .该框架的最底层是输入、输出与编码模块 ,它主要实现了 BER( Basic Encoding Rule) /DER( Distinguish En-coding Rule)、Base64等编码与解码 ,以及与多种存储点之间的输入与输出 .此模块中使用流模块结构实现一次性处理 .PKCS所涉及的算法基础类库是整个框架的核心 ,其上是 X.50 9证书服务模块与 PKCS#7、PKCS#1 2数据保护模块 .框架中的个人安全环境管理模块主要用于维护用户口令、私钥和证书等信息 .文中提出的

非同源末端连接修复通路DNA-PKcs基因在胶质瘤中表达及其机制研究

目的:研究DNA双链断裂损伤修复通路主要成员Ku70、Ku80、ERCC4、Lig4和DNA-PKcs基因在人脑胶质瘤中的mRNA表达及其与肿瘤发生的关系。方法:采用SYBR Green实时定量PCR技术检测36例人原发脑胶质瘤组织和12例正常脑组织中的Ku70、Ku80、ERCC4、Lig4和DNA-PKcs的mRNA水平。用亚硫酸盐处理基因组DNA后,采用甲基化特异的聚合酶链式反应(MSP)检测正常脑组织和胶质瘤组织中DNA-PKcs基因的甲基化水平变化。结果:与正常脑组织相比,Ku70、Ku80、ERCC4、Lig4基因表达量在脑胶质瘤和正常脑组织中无显著性变化(P>0.05),DNA-PKcs基因在脑胶质瘤中表达显性著上调(P=0.002)。DNA-PKcs基因在脑胶质瘤组织中表达量随胶质瘤恶性程度升高而增加。DNA-PKcs基因启动子甲基化程度在正常组织中高于肿瘤组织,表明甲基化程度的减少是引起胶质瘤中DNA-PKcs基因表达增高的原因。结论:DNA-PKcs基因在人脑胶质瘤中较正常脑组织表达显著上调,并且表达与脑胶质瘤的恶性程度相关。DNA-PKcs基因甲基化程度的降低是引起胶质瘤中DNA-PKcs基因表达增高的原因。

辐射生物学中DNA-PKcs主题文献的计量学分析

采用Web of Science核心合集数据库和中国知网数据库获得文献数据,运用文献计量学方法和CiteSpaceⅤ、Hist Cite软件对辐射生物学中DNA依赖性蛋白激酶,催化亚单位(DNA-dependent protein kinase,catalytic subunit,DNA-PKcs)的研究主题在文献、作者、机构、期刊等方面的关联性进行分析。分析结果显示,2006~2016年,在辐射生物学中,DNA-PKcs研究主题的文献总量从34篇增长到503篇;美国是这个领域中研究比较活跃的国家,中国发文量排世界第二,美国、德国和日本之间的联系较为密切;DNA Repair,Journal of Biological Chemistry,Molecular and Cellular Biology等是该研究主题的重要学术期刊,并与Cancer Research,Oncogene,Nature,Cell等高影响期刊之间有较高的共被引频次,表明该研究主题拥有较好的科学前沿性和突破性成果及思路。

骨髓组织PTENmRNA和hTERT、DNA-PKcs检测对急性白血病的临床意义

目的研究抑癌基因、端粒酶及DNA修复基因在白血病细胞中的表达,探讨其临床意义。方法收集儿童急性白血病骨髓活检标本45例(包括初诊组25例和缓解组20例),以及对照组非白血病患儿骨髓标本20例。(1)以骨髓组织石蜡切片作原位杂交PTENmRNA检测,并用免疫组化EliVision法检测端粒酶催化亚单位(hTERT)和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)的表达。比较3组差异。(2)初诊组中20例治疗4周,观察疗效与3项指标表达的关系。结果(1)白血病初诊组骨髓腔充满白血病细胞。PTENmRNA失表达40．0％,hTERT阳性表达84．0％,DNA-PKcs失表达28．0％;3项表达水平均与缓解组和对照组差别显著(P＜0．05)。(2)化学药物治疗4周,未完全缓解者5例;PTENmRNA失表达者占4例,CR率低于阳性表达者(P＜0．05);hTERT和DNA-PKcs阳性表达者各占4例,但无统计学显著差异(P＞0．05)。结论(1)骨髓活检有助于白血病诊断和疗效判定。(2)儿童急性白血病显示有PTENmRNA、hTERT及DNA-PKcs表达异常,表明抑癌基因、端粒酶和DNA修复基因在白血病发生中起到重要作用,可作为基因诊断。(3)白血病初诊组与缓解组显著差别,可辅助疗效判定。(4)治疗效果与多因素相关,PTENmRNA失表达可影响疗效,显示有预测预后价值。

乳腺癌PKCs表达与其分化程度的相关性

为了研究蛋白激酶C(PKC)和乳腺癌分化及转移的相关性 ,采用免疫组化SABC方法检测 48例人乳腺癌的PKC蛋白表达 ,包括PKCα、βI、η和ξ等蛋白 .结果表明 ,与分化低的乳腺癌对比 ,分化高的乳腺癌PKC蛋白表达水平提高 .在临床I II和III级的乳腺癌中 ,PKCη蛋白表达率分别为 6 1.5 %和 9.1% ,具有显著意义 (P <0 .0 5 ) ,PKCξ蛋白表达率分别为 92 .3%和 2 7.3% ,具有极显著意义 (P <0 .0 1) .另外 ,在乳腺癌未转移的病例中 ,PKCs蛋白表达水平普遍较高 ,其中PKCξ与肿瘤转移相关性极显著 (P <0 .0 1) .此外 ,PKCs蛋白表达水平与肿癌患者年龄无关 .以上结果提示 。

DNA-PKcs短发夹RNA载体的构建及其表达

目的构建DNA-PKcsshRNA表达载体,观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响。方法将针对人DNA-PKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞,RT-PCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率,MTT法测定DNA-PKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果 DNA测序分析证实DNA-PKcs shRNA表达载体pSIRENDNA-PKcs shRNA构建成功并在细胞中表达,转染重组载体的A2780细胞DNA-PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降;重组载体转染细胞增殖活性明显降低。结论成功构建DNA-PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA损伤修复基因DNA-PKcs奠定了基础;DNA-PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低。

DSB修复蛋白ATM DNA-PKcs与肿瘤放射敏感性关系的研究进展

放射线主要通过导致细胞DNA双链断裂(DSB)而起到杀死肿瘤细胞的作用,但细胞都有不同程度的DSB修复能力,研究证实DSB修复水平与细胞放射敏感性关系密切。在人类细胞内有2种DSB修复途径:一种是以DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)复合物为主的非同源末端连接(NHEJ)修复,另一种是以毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ATM)为主的同源重组(HR)修复在人体内,NHEJ修复是最主要的修复途径,DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)是DNA-PK复合物的主要功能单位。DNA-PKcs的激酶活性是NHEJ修复所必须的,其在DSB修复中起核心作用近年来的研究显示ATM、DNA-PKcs蛋白表达水平与肿瘤放射敏感性有关。该综述将有关ATM、DNA-PKcs的功能、在肿瘤组织中的表达及与肿瘤放射敏感性关系的研究进行简要回顾。

家居装修及DNA-PKcs表达与儿童白血病发病的关系

目的:研究儿童白血病与家居装修及DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)表达的关系。方法:采用11∶配比病例对照研究方法,病例与对照按年龄、性别、民族配比,应用条件Logistic回归模型分析资料;采用免疫组化SP法检测骨髓组织中DNA-PKcs。结果:母亲怀孕期间装修(OR=5.14)装修后入住时间(OR=0.37)及入住时期气味(OR=2.81)与儿童白血病的发生有关;DNA-PKcs在儿童白血病组的阳性表达率低于对照组(2χ=7.898,P<0.01)。结论:家居装修是儿童白血病的重要危险因素,DNA-PKcs的低水平表达和白血病的发生有关。

上皮性卵巢癌DNA-PKcs和ERCC1表达与预后相关因素分析

目的探讨原发上皮性卵巢癌组织中DNA-PKcs和ERCC1表达与卵巢癌预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测99例上皮性卵巢癌和16例正常卵巢组织中DNA-PKcs和ERCC1的表达。结果 DNA-PKcs和ERCC1在卵巢癌组织中的阳性率分别为60.61%和53.54%,均显著高于正常卵巢组织(P<0.01);DNA-PKcs和ERCC1表达呈显著正相关(r=0.408,P=0.000)。单因素分析显示,DNA-PKcs与ER-CC1共表达,FIGO分期、淋巴结转移、CA125半衰期、残留灶直径均与卵巢癌患者的生存时间有关(P<0.05)。多因素分析显示,ERCC1表达、FIGO分期、淋巴结转移与残留灶直径均是影响卵巢癌预后的独立危险因素。结论 DNA-PKcs和ERCC1在上皮性卵巢癌组织中表达率明显高于正常卵巢组织;联合检测DNA-PKcs与ERCC1表达可作为早期诊断及预测卵巢癌预后的指标。

PKCS11标准下的密钥管理方式研究与实现

PKCS11标准在信息安全领域广泛使用,该标准独立于密码设备、主机和操作系统,有效地屏蔽了各模块间的异构性。密钥是密码运算中不可或缺的一部分,任何安全系统都必须具备安全、可靠、稳定的密钥管理模块。在PKCS11标准下,分析了PKCS11标准中的密钥相关接口,在嵌入式应用程序和主机端动态库两个层面上研究并实现了密钥管理功能模块。测试结果表明,该模块兼容性好,易于实现,在ARM9平台下具有良好的性能。

Ku70和DNA-PKcs在鼻咽癌放疗后复发组织中的表达及其意义

目的:探讨鼻咽癌及放疗后复发鼻咽癌组织中Ku70和DNA-PKcs的表达及其与鼻咽癌放射敏感性的关系。方法:符合入组条件的64例鼻咽癌活检标本,应用免疫组织化学技术检测Ku70和DNA-PKcs的表达,并分析两者之间的关系。结果:鼻咽非角化性癌中Ku70阳性率为83.87%,DNA-PKcs阳性率为74.19%;放疗后复发鼻咽癌中Ku70阳性率为84.85%,DNA-PKcs阳性率为81.82%。Ku70及DNA-PKcs的表达在鼻咽非角化性癌与放疗后复发鼻咽癌两组间比较,差异无显著性(P>0.05)。在放疗后复发鼻咽癌中,Ku70与DNA-PKcs表达呈正相关(P<0.001)。结论:Ku70和DNA-PKcs在放疗后复发鼻咽癌组织中的表达具有相关性,两者尚不能作为预测鼻咽癌放射敏感性的指标。

氢醌染毒HL-60细胞DNA损伤模型构建及其与DNA-PKCS表达之间的关系

目的探讨DNA-PKCS在氢醌致人急性粒细胞白血病HL-60细胞DNA双链断裂损伤修复中作用。方法采用不同剂量氢醌在不同时间范围内诱导HL-60细胞，应用荧光显微镜检测HQ处理各个阶段γ-H2AX焦点的形成。利用Real Time-PCR、免疫荧光染色等分子生物学技术，研究DNA-PKCS基因在转录和翻译水平的表达。结果染毒后18h组和24h组，50um和100um HQ组γ-H2AX焦点的数目随氢醌浓度的递增而明显增加，但两者相比无明显差异。染毒后18h组和24h组，HL-60细胞内DNA-PKCS转录表达水平与蛋白表达水平诱导氢醌浓度之间存在明显的时间剂量依赖关系。结论50um和100um的氢醌18h和24h处理可以诱导HL-60细胞内明显的DNA双链断裂损伤，且损伤程度与DNA-PKCS表达水平直接相关。

nPKCs在人肾小管上皮细胞的表达谱及尿蛋白对其表达的影响

目的检测新型蛋白激酶C(nPKCs)同工酶在人肾小管上皮细胞(TECs)的表达谱及尿蛋白对其表达的影响。方法应用硫酸铵沉淀法提取局灶节段性肾小球硬化症患者尿液中的总蛋白成分;用纯化的尿蛋白在体外按不同浓度刺激人肾近曲小管上皮细胞(HK-2细胞),于24 h和48 h采用免疫细胞化学法检测HK-2细胞中nPKCs的表达变化。结果所提取尿蛋白的主要成分为白蛋白、转铁蛋白和IgG等,分别占72.1%、17.9%和9.5%,其他占0.5%;PKC-θ、PKC-δ和PKC-μ在尿蛋白刺激下表达量上调,而PKC-η与PKC-ε在刺激下表达量变化不明显。结论部分nPKCs可能参与尿蛋白致TECs的损伤过程。