半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)双链RNA依赖的蛋白激酶R(PKR)基因克隆和实时定量表达分析

采用RACE方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)PKR基因(CsPKR),获得了CsPKR全长cDNA序列为2907bp,其中包含1959bp的开放阅读框,100bp的5′非编码区和848bp的3′非编码区。保守结构域分析显示推导的CsPKR氨基酸在N端存在两个特异的dsRBD(dsRNA binding domain dsRBD)结构域,在C端具有多个保守的激酶活性位点,包括ATP结合位点和底物配体结合位点,以及活性环结构A-loop。系统进化树分析显示鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类的PKR具有共同的进化起源,CsPKR与牙鲆PKR的亲缘关系最为密切。荧光定量PCR结果显示,CsPKR基因在健康鱼多个组织中广泛表达,在脑中的表达最高,头肾中表达最低。经鳗弧菌和淋巴囊肿病毒分别感染后,CsPKR基因在免疫相关组织中呈现上调表达趋势,其中感染鳗弧菌12h后在血液中表达量较对照组上升了9.28倍,在感染淋巴囊肿病毒24h后,在肝脏中的表达达到最大,为对照组的9.97倍。以上结果暗示CsPKR基因在半滑舌鳎响应细菌和病毒免疫应答中起重要作用。

猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达

【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。

蛋白激酶PKR在HeLa细胞中的过表达及其siRNA干扰的鉴定

为了研究双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)信号通路对羊痘病毒复制的影响,试验构建了PKR基因的真核表达载体,并在He La细胞中实现了PKR的过表达;从相关文献中筛选了靶向PKR的2对siRNA,检测其对PKR的干扰效果,以RT-PCR方法扩增PKR基因,克隆入表达载体pc DNA3.1(-)/Myc-His(B),对重组质粒进行双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒或siRNAs分别转染He La细胞,Western-blot检测PKR蛋白的表达水平。结果表明:试验成功构建了PKR基因的真核表达载体pc DNA3.1(-)-PKR,重组质粒在He La细胞中得到了表达;2对siRNA具有较好的干扰效果,其中siRNA1、siRNA2对PKR的干扰效率分别达到76%和52%。

禽源PKR基因生物信息学及组织表达分析

为了探讨禽源双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)基因的分子生物学特征并了解其在鸡组织/器官中的表达分布情况,试验首先利用生物信息学在线工具对编码蛋白进行了理化性质分析及二级结构、三级结构预测;然后将禽源PKR基因插入至真核表达载体pEF1α-Myc中,将重组真核表达载体pEF1α-Myc-PKR转染至DF1细胞中,通过间接免疫荧光鉴定和Western-blot鉴定对表达的蛋白进行验证,通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行亚细胞定位;最后采用实时荧光定量PCR检测该基因在SPF鸡不同组织/器官中的分布情况。结果表明:禽源PKR蛋白的分子式为C2744H4332N772O842S23,共编码550个氨基酸,理论分子质量为62346.63 u,等电点(pI)为8.63,不稳定系数为45.54,属于不稳定蛋白;二级结构中,α-螺旋占比为33.27%,延伸链占比为13.64%,β-转角占比为4.73%,无规则卷曲占比为48.36%;三级结构预测模型与人类PKR蛋白的相似性为47.29%。经双酶切验证成功构建了重组真核表达载体pEF1α-Myc-PKR,该载体可在DF1细胞中表达PKR蛋白,蛋白质分子量约为62 ku,具有良好的反应原性,且主要定位于细胞质中。禽源PKR基因在SPF鸡的17个受检组织/器官中均有表达,但在不同组织/器官中的表达量不同;在血液中的表达量最高,然后依次为胰腺、肠、肺脏、脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、腺胃、肌胃、皮肤、气管、脑和肾脏;在关节和肌肉中的表达量极低。说明PKR基因可能参与血液免疫反应,在先天免疫反应中扮演重要角色。

万安玻璃红鲤鱼PKR的克隆鉴定与系统进化分析

本研究以万安玻璃红鲤鱼为材料,通过同源克隆的方法克隆了万安玻璃红鲤鱼双链RNA激活的蛋白激酶(PKRCcvwPKR),并首次克隆到CcvwPKR的剪接异构体。CcvwPKR全长为2145 bp,编码714个氨基酸,CcvwPKR剪接异构体全长1431 bp,编码476个氨基酸。CcvwPKR的剪接异构体是CcvwPKR第477个密码子的G突变为T(gaa477taa),从而使得CcvwPKR的翻译提前终止。氨基酸序列比对和空间结构SMART预测显示,CcvwPKR和CcvwPKR剪接异构体都含有三个双链RNA结合模体(dsRBM),CcvwPKR剪接异构体缺失PKR的C端的激酶结构域。系统进化分析表明,万安玻璃红鲤鱼PKR在进化上与鲤鱼和鲫鱼密切相关。万安玻璃红鲤鱼和目前已有研究的鲤科鱼类PKR一样,分子结构都含有三个dsRBM,三个dsRBM使得其具有更强的结合dsRNA的作用,推测可能与其较强的抗病能力有关。

重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响

目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响。方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Westernblot检测PKR激活情况。结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P<0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用。结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略。

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析

[目的]为进一步研究NS1蛋白在流感病毒跨宿主传播中的作用机制奠定基础。[方法]采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法,从广东不同地区的12~20日龄正常番鸭群中分离鉴定出多株H9亚型水禽禽流感病毒株,对其中4株分离于正常番鸭的禽流感病毒毒株A/duck/ZQ/303/2007（H9N2）（简称A3）、A/duck/FJ/301/2007（H9N2）（简称C1）、A/duck/NH/306/2007（H9N2）（简称D6）和A/duck/SS/402/2007（简称E2）和1株来源于病死番鸭的H9N2亚型鸭流感病毒A/duck/ZC/1/2007（H9N2）（简称L1）的NS1基因进行克隆测序,并与GenBank中收录的其他NS1序列进行比较,分析NS1基因的进化关系。[结果]4株分离于不同地区正常番鸭群的流感病毒株NS1基因与GenBank中注册的H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为99%~100%,氨基酸同源性为95%~100%。而分离于病死鸭的流感病毒株与H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为94%~97%,氨基酸同源性为93%~99%。遗传进化结果表明：分离于正常鸭群的4株流感病毒NS1基因独成一分支,而L1株与2003年的鸡源AY66473株亲缘关系最近。DNAstar软件分析表明：与L1、AF523514（鸭源）、AY664743（鸡源）、EF155262.1（鹌鹑）相比,A3、C1、D6、E2 4株正常鸭H9N2 AIV毒株的NS1基因核苷酸序列在21（R→Q）7、07、1（KE→EG）8、6（A→S）1、24（V→M）、225（S→N）位点处发生改变,NS1基因的双股RNA依赖性蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinase,PKR）结合区（1~100位氨基酸）39、70、71和86位氨基酸发生变化,导致NS1蛋白潜在的抗原决定簇及其特定区域位于蛋白表面的可能性发生明显变化。[结论]NS1蛋白PKR结合区氨基酸序列变化与病毒的致病性有一定关系。