姜黄素联合阿霉素对肝癌PLC/PRF/5细胞增殖凋亡及化疗药物增敏的作用及机制研究

目的探讨姜黄素联合阿霉素对肝癌PLC/PRF/5细胞增殖、凋亡及化疗药物增敏的作用,及其可能的作用机制。方法根据不同的干预药物将细胞分为3组,对照组、阿霉素组、姜黄素联合阿霉素组(联合组),MTT法检测3组肝癌PLC/PRF/5细胞增殖抑制率,RT-PCR检测肿瘤细胞Caspase-3基因的表达,TUNEL免疫荧光检测肿瘤组织凋亡细胞数,比较裸鼠进行不同药物治疗前后肿瘤组织的体积及治疗前后的体积差。结果阿霉素组细胞抑制率高于对照组(P <0. 05),联合组细胞抑制率高于阿霉素组(P <0. 05);阿霉素组Caspase-3基因表达高于对照组(P <0. 01),联合组Caspase-3基因表达高于阿霉素组(P <0. 01);在相同视野范围内,阿霉素组凋亡的肿瘤细胞数多于对照组(P <0. 05),联合组凋亡的肿瘤细胞数多于阿霉素组(P <0. 05)。三组裸鼠治疗前肿瘤体积比较差异无统计学意义(P> 0. 05),阿霉素组治疗后肿瘤体积及治疗前后体积差均小于对照组(P<0. 01),联合组肿瘤体积及治疗前后体积差均小于阿霉素组(P <0. 01)。结论姜黄素与阿霉素联合使用较单独使用阿霉素能增加PLC/PRF/5细胞的药物敏感性,这种作用可能与二者联用后能有效抑制PLC/PRF/5细胞增殖、促进PLC/PRF/5细胞的凋亡有关。

敲除ARID1A对人肝癌细胞系PLC/PRF/5基因表达调控的影响

目的探讨肝癌细胞系PLC/PRF/5中敲除ARID1A后对基因表达调控的影响。方法利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除PLC/PRF/5细胞中ARID1A。然后分别对PLC/PRF/5 ARID1A野生型与敲除型细胞进行全转录组测序分析(RNA-seq),并用DESeq2鉴定ARID1A敲除后差异表达基因。最后,使用Metascape数据库对差异表达基因进行GO功能富集分析。结果成功构建PLC/PRF/5 ARID1A敲除细胞系。利用RNA-seq共筛选出978个差异表达基因,包括480个表达上调差异基因和498个表达下调差异基因。GO功能富集分析显示差异表达基因主要集中在细胞黏附、激素水平调节、激素代谢和MAP激酶活性调节等生物学过程。结论PLC/PRF/5肝癌细胞中,ARID1A可调控大量基因的表达,为进一步研究ARID1A在肝癌发生发展中的作用机制提供了新的线索。

肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞PLC／PRF／5耐药性的影响及其机制

目的:探讨肝星状细胞条件培养基(hepatic stellate cell conditioned medium,HSC-CM)对人肝癌PLC/PRF/5细胞耐药性的影响及其可能的机制。方法:用无血清RPMI 1640培养肝星状细胞LX-2,使其在缺营养的环境下活化,收集其条件培养上清即为HSC-CM。PLC/PRF/5细胞在HSC-CM条件下培养24 h后,顺铂处理12 h或24 h,采用流式细胞术检测PLC/PRF/5细胞的凋亡情况,MTT法检测PLC/PRF/5细胞的增殖,real-time PCR检测PLC/PRF/5细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)相关基因的表达水平。结果:顺铂组12和24 h两个时间点PLC/PRF/5细胞的凋亡率为(22.34±1.12)%和(26.78±1.56)%;HSC-CM+顺铂组细胞的凋亡率为(17.22±1.42)%和(21.52±1.76)%,顺铂组细胞凋亡率显著高于HSC-CM+顺铂组(P<0.05)。同在这两个时间点,顺铂组和HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞的增殖活性分别为(68.65±2.56)%和(79.47±1.43)%,(46.54±3.65)%和(62.77±2.89)%,HSC-CM+顺铂组细胞增殖活性均高于顺铂组(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,与顺铂组相比较,HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞中上皮标记物钙黏蛋白(E-cadherin)的表达下降(P<0.05),而间质细胞标记物神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)以及EMT相关转录因子Snail和ZEB1的表达显著上调(P<0.01)。结论:HSC-CM可能通过诱导PLC/PRF/5细胞发生EMT,从而增强PLC/PRF/5细胞对顺铂的抵抗作用。

NVP-BEZ235诱导自噬在肝癌细胞凋亡中的作用研究

目的以Hep3B和PLC/PRF/5两种肝癌细胞为研究对象,探讨自噬在NVP-BEZ235中引起细胞凋亡的作用.方法人类肝癌细胞Hep3B和PLC/PRF/5在含有10%FBS的DMEM培养基中进行培养,然后再进行细胞活性检测,用于Western blotting检测及线粒体膜电位(MMP)分析.结果 NVP-BEZ235能够有效增加LC3-Ⅱ的表达,并同时降低p62的表达,由此推断,NVP-BEZ235也能够诱导产生自噬,与Atg5的siRNA或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长被抑制.结论 NVP-BEZ235与Atg5的siRNA或者3-MA的联合应用能够促进细胞凋亡,NVP-BEZ235和自噬抑制剂的联合应用可为肝癌和其他恶性肿瘤临床治疗提供新的方法.

淋巴细胞-肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征及意义

目的:探究淋巴细胞和肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征及意义。方法:以人肝癌细胞株PLC/PRF/5与人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)形成cell-in-cell胞内嵌合结构为研究模型,采用流式细胞术分析淋巴细胞钻入肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征。利用流式分选技术分选出小鼠脾淋巴细胞与PLC/PRF/5细胞形成的cell-in-cell胞内嵌合结构,利用平板克隆形成实验检测cell-in-cell胞内嵌合结构对PLC/PRF/5细胞生物学行为的影响。结果:4 h和8 h时,以CD3/CD28抗体活化的PBMC对PLC/PRF/5细胞的伸入率分别为(15.75±1.28)%、(13.49±1.23)%,明显高于未活化PBMC的伸入率[(10.56±0.57)%,(11.38±0.97)%;P<0.05];且活化的PBMC在4 h时的伸入率明显高于未活化PBMC在8 h时的伸入率(P<0.05)。小鼠脾淋巴细胞伸入PLC/PRF/5细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构后,PLC/PRF/5细胞的克隆形成率明显高于未形成cell-in-cell胞内嵌合结构的PLC/PRF/5细胞[(32.25±2.32)%vs(21.92±2.02)%,P<0.05]。结论:活化后PBMC伸入PLC/PRF/5细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的比率升高、时间提前,同时形成胞内嵌合结构的肿瘤细胞在体外克隆形成能力增强。

6MV-X射线对肝癌细胞凋亡及周期分布的影响

目的:研究人肝癌细胞接受不同剂量或时间的6MV-X线照射后,对细胞凋亡和周期进程的影响。方法:用流式细胞术检测6MV-X线照射4Gy后不同时间以及不同剂量6MV-X线照射后24h HepG2和PLC/PRF/5两种细胞的细胞凋亡和周期分布状况。结果:4Gy 6MV-X线照射后24h,HepG2细胞凋亡率高于PLC/PRF/5细胞,分别为(7.61±0.77)%和(5.63±0.87)%(P<0.05),且随时间和剂量增加,差异越显著;HepG2细胞受4Gy照射后12h,G0/G1期比例下降,为(40.56±1.59)%,后逐渐上升,G2/M期比例增高,为(13.28±1.02)%,随后逐渐下降;2-6Gy照射24h后,G0/G1期比例逐渐上升,G2/M期比例逐渐下降;PLC/PRF/5细胞G2/M期比例在照射后24h阻滞最明显(22.11±1.48)%,后逐渐降低,随照射剂量增加而增大。结论:2-6Gy 6MV-X线照射可诱导HepG2与PLC/PRF/5细胞凋亡,并改变周期进程,HepG2细胞发生G1和G2期阻滞,PLC/PRF/5发生G2期阻滞。

肝原位移植瘤裸鼠模型的建立及活体荧光成像检测

目的建立能够通过活体荧光成像系统实时监测肿瘤进展的肝原位移植瘤裸鼠模型。方法重组质粒pcDNA3.1-Luc转染细胞构建稳定表达荧光素酶的PLC/PRF/5肝癌细胞株,将该细胞注入裸鼠肝脏实质内,应用活体成像技术动态监测肿瘤进展情况,解剖荧光信号阳性裸鼠观察肿瘤组织生长情况。免疫荧光检测肿瘤组织中HBsAg表达。结果对裸鼠肝原位移植瘤应用活体荧光系统成像,在肿瘤细胞注射部位检测到荧光信号,解剖动物后可在肝脏组织中观察到异质细胞团块。免疫荧光证实移植瘤中有HBsAg表达。结论肝脏原位移植瘤裸鼠模型建立成功,为抗肝癌药物的研发提供了工具。

通道抑制剂NVP与3-MA联合应用对肝癌细胞凋亡的影响

目的以人类Hep3B和PLC-PRF-5两种肝癌细胞为研究对象,探讨自噬在NVP-BEZ235引起的细胞凋亡中的作用.方法人肝癌细胞Hep3B和PLC-PRF-5在培养基中培养,行细胞活性检测实验,洗涤后应用流式细胞仪对JC-1阳性细胞进行检测,并行线粒体膜电位(MMP)分析.结果 NVP-BEZ235能够有效增加LC3-Ⅱ的表达,并同时降低p62的表达,当NVP-BEZ235与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长明显被抑制.结论 NVP-BEZ235与3-MA联合应用能够促进细胞凋亡,为肝癌和其他恶性肿瘤的临床治疗提供参考.

女贞子提取物抑制人肝癌细胞血管生长因子表达作用研究

目的:研究女贞子提取物中熊果酸对人肝癌细胞生长抑制作用及对血管内皮生长因子(VEGF),转化生长因子-α(TGF-α)表达的抑制作用,探讨其抗肿瘤机制。方法:女贞子提取物与PLC/PRF/5细胞孵育,以四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测其对人肝癌细胞PLC/PRF/5生长的抑制作用,并通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞培养上清液中VEGF,TGF-α的表达;小鼠右前肢腋皮下接种瘤细胞,连续给药14 d后取瘤组织,检测小鼠肿瘤的抑制率,并以免疫组织化学方法检测瘤组织VEGF,TGF-α表达。结果:女贞子提取物中的熊果酸在体内和体外试验结果均显示抑制人肝癌细胞生长,并对VEGF,TGF-α表达有明显的抑制作用。结论:女贞子提取物具有抗肿瘤作用,抑制VEGF,TGF-α表达可能是其抗肿瘤作用机制之一。