利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pmepa1基因组序列的sgRNA序列,构建pX333载体并转染进入TCMK1细胞,采用流式分选m Cherry阳性细胞、单克隆细胞扩增和测序鉴定Pmepa1敲除细胞,Western blot验证Pmepa1基因敲除情况。采用RT-PCR和Western blot分析Pmepa1敲除对TGF-β1诱导的R-Smad的活化和纤维化的影响。【结果】将sgRNA设计在Pmepa1第2个外显子,pX333-Pmepa1质粒转染TCMK1细胞48 h后,观察到mCherry荧光蛋白的表达,流式细胞分析转染效率约为17%,pX333-Pmepa1质粒转染阳性细胞经流式分选和单克隆扩增培养,得到19个细胞克隆,对Pmepa1基因位点上sgRNA靶点序列PCR扩增测序分析发现2个双等位基因移码突变细胞,Western blot验证Pmepa1蛋白表达缺失,表明Pmepa1基因敲除TCMK1细胞株构建成功,与未敲除细胞相比,Pmepa1敲除细胞在TGF-β1刺激下,p-Smad2和p-Smad3的表达显著升高,并且促进纤维化基因Fibronectin和Collagen I的表达。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功构建Pmepa1基因敲除TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,为Pmepa1蛋白的功能研究建立了细胞模型以及Pmepa1在纤维化中的重要作用。

PMEPA1在前列腺癌中的表达及临床意义

目的探讨一种编码受雄激素诱导的前列腺跨膜蛋白基因——PMEPA1(transmembrane prostateandrogen induced RNA)的表达,预测前列腺癌非激素依赖型变化的临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测PMEPA1及GSTP1 mRNA在前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3、良性前列腺增生上皮细胞及33例前列腺癌和16例前列腺增生组织中的表达情况。结果GSTP1及PMEPA1在前列腺癌细胞系中的表达均下调。GSTP1在6.1%的前列腺癌患者中表达上调,在81.8%的患者的前列腺癌组织中表达下调,在12.1%的患者中表达无明显差异;PMEPA1在27.3%的前列腺癌患者的前列腺癌组织中表达上调,在27.3%的患者中表达下调,在45.4%的患者中表达无明显差异。统计分析表明,GSTP1的表达与年龄有关,与PSA、TNM分期、有无骨转移及分化程度无显著关系;PMEPA1的表达与肿瘤的分化程度及是否有骨转移有关,而与年龄、PSA、TNM分期无显著关系。结论PMEPA1有可能作为区分临床预后较差的前列腺癌的分子学标记,但需要进一步做大样本的研究。

下调PMEPA1表达对肝癌细胞HepG2增殖与转移的影响

目的观察沉默前列腺跨膜雄激素诱导蛋白1(PMEPA1)对肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响。方法应用qRT-PCR、免疫组化染色和Western blot方法检测PMEPA1在肝癌细胞HepG2中mRNA和蛋白表达情况。分析PMEPA1在肝细胞性肝癌(HCC)组织中的表达及其与临床病理特征的关系。使用siRNA干扰肝癌细胞HepG2中PMEPA1的表达,并应用MTT法,Transwell法检测肝癌细胞HepG2的增殖及迁移能力。结果PMEPA1蛋白在HCC组织中表达高于正常肝组织。肝癌组织内PMEPA1蛋白表达与HCC患者肿瘤大小(P=0.0366)和淋巴结转移(P=0.0358)密切相关。与HCC患者性别、年龄、AFP水平高低、脉管浸润、组织学分级及TNM分期等均无相关性。PMEPA1-siRNA肝癌细胞HepG2 PMEPA1蛋白及mRNA表达均下调(P<0.01)。siPMEPA1转染细胞增殖能力及迁移能力均降低(P<0.01)。结论PMEPA1表达可能促进HCC的增殖和迁移。

跨膜前列腺雄激素诱导蛋白1(PMEPA1)促进乳腺癌细胞迁移并维持乳腺癌细胞的间质样特性

目的探究转化生长因子β(TGF-β)信号下游重要靶分子跨膜前列腺雄激素诱导蛋白1(PMEPA1)对乳腺癌细胞运动迁移能力的影响及其在上皮间质转化(EMT)过程中的作用。方法用TGF-β刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞,并用小分子抑制剂SB431542抑制TGF-β信号通路后,采用Western blot法检测PMEPA1的表达水平;设计针对PMEPA1分子的特异性小干扰RNA(siRNA),采用实时定量PCR检测干涉效率;干涉MDA-MB-231细胞中PMEPA1的表达后,采用划痕实验和TranswellTM实验检测PMEPA1基因沉默对乳腺癌细胞迁移能力的影响;采用鬼笔环肽对细胞骨架进行标记,观察PMEPA1基因沉默后MDAMB-231乳腺癌细胞的形态变化。结果乳腺癌细胞中,PMEPA1分子受经典TGF-β/Smad信号途径的作用发生显著上调;沉默PMEPA1的表达能显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力,并使细胞形态由间质样向上皮样转变。结论 PMEPA1促进乳腺癌细胞迁移并维持乳腺癌细胞的间质样特性。

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.

pPMEPA1多肽纳米复合物的构建及其抗前列腺癌细胞迁移的体外评价

目的:制备一种二硫键交联的精氨酸-天冬氨酸多肽聚合物(SRD),用作包载质粒PMEPA1(pPMEPA1,DPM)的载体,体外评价SRD/DPM复合物抗前列腺癌细胞迁移的疗效。方法:以低浓度的双氧水为氧化剂,半胱氨酸为交联剂,合成SRD,用1 H-NMR对其进行结构鉴定。将SRD与DPM按照不同氮磷比(N/P)涡旋混合,使其通过静电引力结合成SRD/DPM复合物。利用粒度电位分析仪测定SRD/DPM复合物的粒径和zeta电位,用琼脂糖凝胶电泳考察SRD对DPM的包载能力。将SRD和SRD/DPM复合物分别与前列腺癌细胞DU145共培养,考察细胞对复合物的摄取情况,以及复合物对癌细胞迁移能力的影响。结果:1H-NMR图谱显示SRD被成功合成。SRD与DPM通过静电引力结合,形成纳米复合物,表面呈正电性。凝胶电泳实验结果显示,N/P>2.5的SRD具有较强的基因药物包载能力。将SRD与DU145细胞共孵育24h后,细胞活力仍>50%。细胞摄取与Transwell实验显示,与RD单体相比,SRD能够显著增强DU145细胞对复合物的摄取,提高DPM抑制前列腺癌细胞迁移的效果。结论:以SRD作为基因药物载体传递DPM,可抑制前列腺癌细胞迁移,有望用于骨转移前列腺癌的治疗。

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。

宫腔粘连患者子宫内膜组织跨膜前列腺雄激素诱导蛋白1和转化生长因子β1的表达情况

目的探讨跨膜前列腺雄激素诱导蛋白1(prostate transmembrane protein androgen induced 1,PMEPA 1)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)患者子宫内膜组织中的表达量及相关性。方法选取武汉大学人民医院妇产科2016年6月至2017年12月因IUA行宫腔镜手术治疗的患者50例为粘连组,20例因不孕症行宫腔镜手术的非IUA患者为对照组,采集两组患者子宫内膜组织,根据粘连的评分标准评分并分级,粘连组又分为轻度组(10例)、中度组(19例)、重度组(21例),收集的内膜组织采用qRT-PCR和Western blot检测PMEPA 1和TGF-β1的mRNA和蛋白的表达量并在蛋白表达水平作两者相关性分析。结果 (1)PMEPA 1 mRNA的表达:中、重度粘连组低于对照组和轻度粘连组,重度组低于中度组,差异均有统计学意义(t=7.719、12.84、2.614,P<0.0001、<0.0001、<0.05);轻度组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)PMEPA 1蛋白的表达:轻、中、重度粘连组均低于对照组(t=2.886、6.669、15.47,P<0.05、<0.001、<0.0001),重度组低于中度组(t=5.119,P<0.0001)。(3)TGF-β1的mRNA和蛋白的表达:粘连组高于对照组(t=4.988、8.816、9.0514,P均<0.001)。(4)PMEPA1和TGF-β1在中、重度组中呈负相关关系(r=-0.6342、-0.8407,P=0.0035、<0.0001)。结论 PMEPA 1和TGF-β1可能参与IUA的发生发展。